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Digitale PCR

Der neue Standard in der PCR – digitale PCR

Die Nadel im Heuhaufen finden

Forscher, die mit sensitiven Applikationen wie Kopienzahlvariationen und dem Nachweis seltener Targets arbeiten, sehen sich häufig mit der Herausforderung konfrontiert, schwächste genetische Signale vor einem starken Hintergrund zu identifizieren. Besonders schwierig ist das, wenn in einem großen Pool an negativen ein einziges positives Signal enthalten ist. Das Finden eines seltenen Allels oder einer mutierten Sequenz ist wie die sprichwörtliche Suche nach der Nadel im Heuhaufen! Die digitale PCR (dPCR) ist eine Technik, bei der die Probe in eine große Anzahl einzelner Reaktionen partitioniert wird. Diese Herangehensweise macht es erstaunlich einfach, das eine positive Signal nachzuweisen. In derartigen Fällen schließt die niedrigere Nachweisgrenze eine herkömmliche quantitative Real-time PCR als praktikable Lösung aus.

Wir bei QIAGEN sehen es als unsere Pflicht an, Sie mit allem zu versorgen, das Sie brauchen, um die mit auf Real-time und digitaler PCR basierenden Forschungsapplikationen verbundenen Hürden zu überwinden. Am Ende ist das Finden einer Nadel im Heuhaufen vielleicht gar nicht so schwierig, wie es klingt.

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Wie schafft die dPCR einen Mehrwert gegenüber der qPCR?
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Neugierig? Das haben wir uns schon gedacht. Seien Sie dabei, wenn wir in unserer ersten Episode von Q-rious am 29. März mehr über „d before q in PCR“ verraten.

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Ein wachsender Katalog publizierter Forschungsergebnisse
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Forschende weltweit nutzen das QIAcuity Digital PCR System, um ihre Arbeit in verschiedenen Applikationen voranzutreiben. Hier stellen wir Ihnen einige interessante Studien vor, die als solide Belege für die Zugänglichkeit, die Relevanz und das Potenzial dieser digitalen PCR-Technologie mit Nanoplatten dienen.

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Digitale PCR für die AAV-Titration
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Kostenloses 5-plex-dPCR-Assaydesign!
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Vorgehen zur Durchführung einer digitalen Multiplex-PCR
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Entdecken Sie Vorzüge, Applikationen und Publikationen mit Multiplex-dPCR – für Anfänger und Experten. Erhalten Sie außerdem Tipps für die Entwicklung Ihres eigenen Multiplex-dPCR-Assays.
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Ein einfacher und schneller Workflow
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Es ist ein eigenständiges, vollständig integriertes System, das Partitionierung, Thermocycling und Bildgebung auf effiziente Weise kombiniert und Ergebnisse in unter 2 Stunden bereitstellt. Diese interaktive Demo veranschaulicht Schritt für Schritt den kompletten QIAcuity Nanoplate dPCR-Workflow.
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Realisieren Sie das volle Potenzial der digitalen PCR

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Video vor COVID-19 aufgenommen
Ihre Zukunft ist digital – warum sollte Ihre PCR es nicht auch sein? Stellen Sie sich vor, die Vertrautheit und Anwenderfreundlichkeit der qPCR beizubehalten und die höhere Sensitivität und Präzision der digitalen PCR zu erhalten, ohne dabei die Zeit bis zur wissenschaftlichen Erkenntnis zu verlängern. Der QIAcuity, das vollständig integrierte Nanoplatten-basierte digitale PCR-System von QIAGEN, wurde unter Berücksichtigung Ihrer Forschungsanforderungen und der Beschränkungen der aktuell verfügbaren Methoden konzipiert. Es ist an der Zeit, die Umstellung von der qPCR zu vereinfachen und Ihre kritischen Forschungsapplikationen auf die sich wandelnde Landschaft der digitalen PCR vorzubereiten.
Skalierbarkeit
Skalierbarkeit
  • Gerätekonfigurationen für geringen bis hohen Durchsatz – mit 1, 4 und 8 Platten
  • Bis zu 2 integrierte Thermocycler
Durchsatz
Durchsatz
Abhängig von der verwendeten Platten- (24 oder 96 Wells) und Gerätekonfiguration (1, 4 oder 8 Platten) kann die Zahl der pro Tag verarbeiteten Proben von 96 auf bis zu 1248 gesteigert werden
Multiplexierung
Multiplexierung
  • Bis zu 5 Detektionskanäle (2-plex und 5-plex, exklusive Referenz)
Zeit bis zum Ergebnis
Zeit bis zum Ergebnis
  • Einfacher und schneller plattenbasierter Workflow, der Anwender in unter 2 Stunden von der Probe zum Ergebnis führt
Sensitivität
Sensitivität
  • Feste(s) Partitionierungsgröße und -volumen
  • Die Anzahl der Partitionen und das eingesetzte Volumen sind abhängig von der verwendeten Plattenkonfiguration – ca. 8500 oder 26.000 Partitionen pro Well

Vorteile gegenüber der tröpfchenbasierten digitalen PCR-Technologie

Die Nanoplatten-basierte Technologie bietet signifikante Vorteile gegenüber der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR). Dazu gehören:

• feste Partitionen, die Variationen bei Größe und Koaleszenz verhindern
• versiegelte Nanoplatten, die Kontaminationen von Well zu Well verhindern
• die Möglichkeit schnellerer Readouts durch gleichzeitiges Auslesen aller Partitionen einer Probe
• anwenderfreundliche, bekannte Platten, die sich genau wie bei der qPCR ganz einfach pipettieren lassen
• die Eignung der Platten für die Front-End-Automation

Lesen Sie mehr über dPCR vs. ddPCR

Video vor COVID-19 aufgenommen
Die Verwendung des QIAcuity ist ganz einfach
Stellen Sie auf einen einfachen und schnellen Workflow mit digitaler PCR um.
Serie von Experten-Webinaren
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Die Themen unserer Webinare zur digitalen PCR rangieren von der Einführung in die Technologie bis hin zu tiefgehenden Diskussionen darüber, wie die neue Nanoplatten-basierte digitale PCR-Lösung die Vertrautheit bekannter qPCR-Workflows mit dem Potenzial der Partitionierung verbindet, um Ihre Forschung weiterzubringen.
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Die Zukunft gehört der digitalen PCR
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Interne und externe Experten erklären aus ihrer Sicht, wie die digitale PCR molekulare Messungen genauer und präziser macht und wie die neue QIAcuity Nanoplatten-dPCR in Zukunft in jedem Labor zur Realität werden kann.
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QIAcuity geht on(line)
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Die Magie ist im Inneren
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Sie liegt in der nahtlosen Integration aller Komponenten des dPCR-Arbeitsablaufs in einem vollautomatischen Instrument, das die in jedem Labor erforderliche Geschwindigkeit und den Durchsatz liefert. Die Technologie der Nanoplatten-Mikrofluidik mit ihrer Präzision und Sensitivität verschafft jedem Lauf den entscheidenden Vorsprung

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PCR am Scheideweg
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Wenn es bei der molekularbiologischen und Genomik-Forschung um die Quantifizierung von Nukleinsäuren geht, stehen Wissenschaftler häufig am Scheideweg. Die Wahl der Technologie ist applikationsabhängig.
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Wofür wird digitale PCR eingesetzt?
Kurz gefasst wird die digitale PCR für die folgenden Zwecke eingesetzt: Nachweis von seltenen Sequenzen, Kopienzahlvariationen und mikrobiellen Targets; Quantifizierung seltener Mutationen, einschließlich aus Flüssigbiopsien; Einzelzellanalyse; Messung der Viruslast; Analyse der Genexpression; Quantifizierung von Next Generation Sequencing(NGS)-Bibliotheken und vieles anderes.
Was ist der Unterschied zwischen PCR und digitaler PCR?
Der Unterschied zwischen PCR und digitaler PCR besteht darin, dass die Endpunkt- oder herkömmliche PCR qualitative oder semiquantitative Analysen bietet, während die dPCR eine absolute Quantifizierung ermöglicht. Die digitale PCR ist schneller, präziser und reproduzierbarer, sie bietet Multiplexing-Fähigkeiten, erfordert aber auch eine größere anfängliche Investition.
Was sind die Vorteile der digitalen PCR?
Zu den Vorteilen der digitalen PCR gehören die absolute Target-Quantifizierung ohne Standards oder Referenzkurven, eine hohe Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren, eine zum Nachweis geringfügiger Änderungen erforderliche hohe Präzision, eine hohe Sensitivität, eine niedrige Nachweisgrenze und eine hohe Reproduzierbarkeit, insbesondere zwischen verschiedenen Laboren.
Wo liegen die Nachteile der digitalen PCR?
Zu den Nachteilen der digitalen PCR zählen ein leicht schmalerer dynamischer Bereich als bei der qPCR. Die Methode ist nicht ideal für große Amplifikate geeignet.
Kann ich eine leere Nanoplatte ohne Versiegelung für einen Trockenlauf verwenden?
Die QIAcuity Gerätesoftware lässt die Messung und Verarbeitung einer Platte ohne Versiegelung nicht zu. Wenn Sie einen Trockenlauf durchführen möchten, verwenden Sie bitte eine versiegelte Platte und richten Sie diese Platte in der QIAcuity Software Suite ein.
Wie genau ist die digitale PCR?
Die Genauigkeit der digitalen PCR variiert zwischen den verschiedenen dPCR-Systemen und -Applikationen. Eine Vergleichsstudie der Präzision und Sensitivität von dPCR vs. qPCR ergab, dass die dPCR die Standardabweichung von Replikaten um das Dreifache senkt. Hinsichtlich der Sensitivität beim Mutationsnachweis ist bei der qPCR ab einer Mutationsrate von 10 % keine zuverlässige Quantifizierung mehr möglich, bei der dPCR ab einer Mutationsrate von 0,1 %.
Warum der Name digitale PCR?
Der Name „digitale PCR“ kommt daher, dass die Methode binäre Ein-/Aus- oder Ja-/Nein-Ergebnisse liefert. Digitale Assays können nur zwischen zwei Signalen unterscheiden und nicht zwischen einer Reihe von von Möglichkeiten. So sind die Dinge entweder schwarz oder weiß statt „50 shades of grey“. Speziell bei der dPCR unterscheidet der Sensor zwischen einer positiven und negativen Partition und liefert ein Ja oder Nein als Antwort auf die Frage, ob das Target in der Partition vorhanden ist.
Wie unterscheidet sich das Gerät für die digitale PCR von QIAGEN von den bereits im Handel erhältlichen Systemen?

Unsere QIAcuity Systeme für die digitale PCR arbeiten mit einer Nanoplatten-basierten Technologie und bieten damit signifikante Vorteile gegenüber der Technologie der tröpfchenbasierten digitalen PCR (droplet digital PCR, ddPCR). In die dPCR-Nanoplatte fest integrierte Partitionen verhindern Variationen bei Größe und Koaleszenz, wie sie bei der ddPCR beobachtet werden. Abgesehen davon führt die gleichzeitige Auslesung aller Probenpartitionen in Nanoplatten schneller zum Ergebnis. Nanoplatten sind nicht nur anwenderfreundlich und genau wie die qPCR leicht zu pipettieren, sondern auch für die Front-End-Automation geeignet. Am wichtigsten ist die Tatsache, dass ordnungsgemäß versiegelte Nanoplatten eine Probenverdunstung und Kontaminationen von Well zu Well verhindern. Partitionierung, Thermocycling und Bildgebung sind in einem vollautomatisierten Gerät integriert, das Ergebnisse in weniger als zwei Stunden liefert – anders als einige andere digitale PCR-Systeme, die mehr als vier Stunden benötigen. Darüber hinaus machen skalierbare Konfigurationen und die höhere Multiplexierungsfähigkeit die Anpassung der digitalen PCR mit QIAcuity an alle Arten von Laboren und Applikationsanforderungen möglich. Mithilfe der QIAcuity Software Suite können digitale PCR-Experimente, Proben sowie Reaktionsgemische definiert, Nanoplatten zugewiesen und an das QIAcuity Gerät übertragen werden. Nach dem Lauf können Daten analysiert, Berichte erstellt und Daten für die Remote-Analyse exportiert werden.

Wie viele Proben kann ich an einem Tag analysieren?

Die QIAcuity Gerätesoftware lässt die Messung und Verarbeitung einer Platte ohne Versiegelung nicht zu. Wenn Sie einen Trockenlauf durchführen möchten, verwenden Sie bitte eine versiegelte Platte und richten Sie diese Platte in der QIAcuity Software Suite ein.

Wie viele Targets kann ich in einer Einzelreaktion nachweisen?

Unsere QIAcuity Systeme für die digitale PCR arbeiten mit einer Nanoplatten-basierten Technologie und bieten damit signifikante Vorteile gegenüber der Technologie der tröpfchenbasierten digitalen PCR (droplet digital PCR, ddPCR). In die dPCR-Nanoplatte fest integrierte Partitionen verhindern Variationen bei Größe und Koaleszenz, wie sie bei der ddPCR beobachtet werden. Abgesehen davon führt die gleichzeitige Auslesung aller Probenpartitionen in Nanoplatten schneller zum Ergebnis. Nanoplatten sind nicht nur anwenderfreundlich und genau wie die qPCR leicht zu pipettieren, sondern auch für die Front-End-Automation geeignet. Am wichtigsten ist die Tatsache, dass ordnungsgemäß versiegelte Nanoplatten eine Probenverdunstung und Kontaminationen von Well zu Well verhindern. Partitionierung, Thermocycling und Bildgebung sind in einem vollautomatisierten Gerät integriert, das Ergebnisse in weniger als zwei Stunden liefert – anders als einige andere digitale PCR-Systeme, die mehr als vier Stunden benötigen. Darüber hinaus machen skalierbare Konfigurationen und die höhere Multiplexierungsfähigkeit die Anpassung der digitalen PCR mit QIAcuity an alle Arten von Laboren und Applikationsanforderungen möglich. Mithilfe der QIAcuity Software Suite können digitale PCR-Experimente, Proben sowie Reaktionsgemische definiert, Nanoplatten zugewiesen und an das QIAcuity Gerät übertragen werden. Nach dem Lauf können Daten analysiert, Berichte erstellt und Daten für die Remote-Analyse exportiert werden.

Welchem Zweck dient der Referenzkanal des QIAcuity?

Wenn Sie das QIAcuity dPCR-Gerät für acht Platten verwenden, können Sie bis zu 312 Proben in 24-Well-Nanoplatten und bis zu 1248 Proben in 96-Well-Nanoplatten analysieren. Weitere Informationen finden Sie hier.

Neu bei der dPCR?
Wenn Sie bereit sind, in die Welt der dPCR einzutauchen, aber nicht wissen, wo Sie anfangen sollen, finden Sie an diesem informativen Hub alle für Anfänger geeigneten wichtigen Themen.