miRCURY LNA miRNA PCR Assays for Digital PCR

• Vollständige miRBase-Abdeckung ermöglicht miRNA-Profiling für jeden Organismus
• Unübertroffene Sensitivität erlaubt miRNA-Quantifizierung anhand von nur 1 pg Gesamt-RNA
• Hohe Spezifität ermöglicht Unterscheidung zwischen eng verwandten miRNAs und zwischen reifer miRNA und Vorläufern
• Schnelles dPCR-Protokoll aus zwei Schritten dauert weniger als 3 Stunden
• Absolute Quantifizierung von miRNA-Expressionsänderungen mittels dPCR unter Verwendung des QIAcuity Gerätes und des QIAcuity EG PCR Kit

miRCURY LNA miRNA PCR Assays sind individuelle miRNA-PCR-Primersets, die eine höchst sensitive und spezifische miRNA-Quantifizierung erlauben. Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtsprimer für die PCR-Amplifikation sind miRNA-spezifisch und wurden mittels LNA-Technologie optimiert. Die Assays werden im Röhrchenformat bereitgestellt und enthalten ausreichend Primer für 166 Reaktionen in einer Nanoplate 8.5k (12 μl je Reaktion) oder 50 Reaktionen in einer Nanoplate 26k (40 μl je Reaktion). Der vorgelagerte cDNA-Syntheseschritt wird mit dem miRCURY LNA RT Kit durchgeführt, während die digitale PCR-Amplifikation mit einem QIAcuity EG PCR Kit auf dem QIAcuity Gerät erfolgt.

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Optimierte digitale PCR-Analyse mit den QIAcuity EG PCR Kits und dem QIAcuity Gerät

Die miRCURY LNA miRNA PCR Assays dienen der hochspezifischen Zielamplifikation. Die Quantifizierung kann mittels zweier PCR-Methoden erfolgen: qPCR mit Standard-Real-time-Thermocyclern und digitale PCR mit dem QIAcuity Gerät und dem QIAcuity EG PCR Kit. Nach der cDNA-Synthese mit dem miRCURY LNA RT Kit ermöglicht die digitale PCR eine hochpräzise Quantifizierung des Zielmoleküls, wobei selbst kleinste Expressionsänderungen bei geringsten Konzentrationen nachgewiesen werden. Ein Untergruppe von zentralen miRNAs wurde auf dem QIAcuity Gerät experimentell validiert.

LNA steigert die PCR-Leistung

Die miRCURY LNA miRNA PCR Assays wurden unter Einhaltung strenger Designkriterien und im Labor validierter Algorithmen entwickelt. Der strenge Assay-Auswahlprozess stellt sicher, dass jedes Primer-Set die zuverlässigsten und genauesten Ergebnisse bei höchster Spezifität und Effizienz liefert. Die T_m-Normierung und die LNA-Verstärkung verleihen den Primern eine höhere Bindungsaffinität als bei herkömmlichen DNA-Primern, was die Sensitivität und Spezifität des Assays deutlich erhöht.

Verglichen mit anderen miRNA-PCR-Systemen, die entweder Primer mit Haarnadelstruktur oder Standard-DNA-Primer verwenden, liefern die LNA-optimierten Primer eine signifikant höhere Sensitivität, besonders bei AT-reichen miRNAs.

Ein einzigartiges System für das miRNA-Profiling

Die miRCURY LNA miRNA PCR Assays bieten durch Kombination aus universeller RT mit LNA-PCR-Amplifikation die beste auf dem microRNA-PCR-Markt verfügbare Kombination aus Leistung und Benutzerfreundlichkeit (siehe Abbildung  Schematischer Überblick über das miRCURY LNA miRNA digitale PCR-System). Die universelle RT ermöglicht die Verwendung einer cDNA-Synthesereaktion des ersten Stranges als Template für mehrere miRNA-Real-time PCR-Assays. Dies spart wertvolle Probe sowie Zeit im Labor und reduziert technische Abweichungen. Darüber hinaus sind sowohl die Vorwärts- als auch die Rückwärtsprimer für die PCR-Amplifikation miRNA-spezifisch und wurden mittels LNA optimiert. Dadurch werden 1) eine außergewöhnliche Sensitivität und ein äußerst schwacher Hintergrund für eine genaue Quantifizierung sehr niedriger miRNA-Konzentrationen und 2) hochspezifische Assays, die die Unterscheidung zwischen eng verwandten miRNA-Sequenzen ermöglichen, erreicht.

Das Prinzip der dPCR-Reaktion in den QIAcuity Nanoplates finden Sie hier beschrieben.

Abdeckung (Coverage)

Es sind mehr als 20.000 Assays verfügbar, die alle Organismen in der miRBase 20 abdecken. Über 1.200 Assays wurden im Labor anhand von sowohl synthetischen als auch verschiedenen biologischen Proben vollständig im Hinblick auf Sensitivität, Spezifität, Effizienz und Hintergrund validiert. Die übrigen Assays wurden in silico anhand eines umfassenden Design-Algorithmus validiert, der hochwertige, speziespezifische und LNA-optimierte Assays mit optimaler Sensitivität und Spezifität für jeden Organismus gewährleistet. Das bedeutet, dass mehrere verschiedene Assays auf die gleiche Sequenz abzielen können. Letztendlich wird der Assay für jede Spezies basierend auf dem genetischen Hintergrund des Organismus ausgewählt. Falls Sie mit neuartigen miRNAs, z. B. aus einem NGS-Experiment, arbeiten, sind auch maßgeschneiderte LNA-miRNA-Primersets für jede beliebige miRNA verfügbar.

Referenzgen-Assays zur Normalisierung

Für die dPCR sind fünf validierte Referenzgen-Primersets verfügbar. Sie ermöglichen eine qualitativ hochwertige Datennormalisierung und das Generieren zuverlässiger Daten für viele verschiedene Probentypen (siehe nachstehende Tabelle). Diese Kontrollprimersets zielen auf endogene, kleine, nicht codierende RNAs ab, die beständig und relativ stabil über verschiedene Gewebe hinweg exprimiert werden (siehe Abbildung  Expressionsniveaus von Referenzgenen in verschiedenen menschlichen Geweben). Die Kontroll-Referenzgene bieten die Möglichkeit zur genauen und zuverlässigen Normalisierung über verschiedene miRNA-Expressionsniveaus hinweg. Weitere Informationen finden Sie auf der Seite miRCURY PCR Controls.

Liste der verfügbaren Referenzgen-Assays

* Validiert zur Verwendung für die digitale PCR.

Ein einfacher und schneller plattenbasierter Workflow.

Partitionierung, Thermocycling und Bildgebung sind komplett in einem vollautomatischen Instrument integriert, das Ergebnisse in unter zwei Stunden liefert. Nanoplattenformate eignen sich zur automatisierten Probenvorbereitung, wodurch sich der Zeitaufwand weiter verringert.

Wie auch bei qPCR-Experimenten umfasst die Probenvorbereitung die Überführung der verdünnten Proben und die Zugabe von Master-Mix und Primern in eine 96- oder 24-Well-Nanoplatte. Das System integriert Partitionierung, Thermocycling und Bildgebung in nur einem Vollautomaten, der den Benutzer in weniger als 3 Stunden von der Probe zum Ergebnis führt. Mit der Software Suite lassen sich Fernauswertungen durchführen, die die Konzentration der Zielsequenzen in Kopien pro Mikroliter liefern sowie Optionen für integrierte Qualitätskontrollen bieten.

Die miRCURY LNA miRNA PCR Assays ermöglichen in Kombination mit dem QIAcuity Digital PCR System die digitale PCR-Analyse zur Quantifizierung reifer miRNA.