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Digitale PCR

dPCR für Anfänger

Entwicklung der dPCR

Die komplexen Forschungsfragen von heute erfordern eine Informationstiefe, die über die Kapazität traditioneller PCR-Technologien hinausgeht. Die digitale PCR der dritten Generation verkleinert diese Lücke und wird zu einer wesentlich simpleren und praxistauglicheren Technik, um diese alltäglichen Forschungsfragen zu klären.

Das Konzept der digitalen PCR existiert seit etwa 1992, als Sykes et al.die „PCR mit limitierender Verdünnung“ beschrieben. Diese allgemeine Methode arbeitete mit Endpunktanalyse und Poisson-Statistik zur Quantifizierung der absoluten Zahl an in einer Probe vorliegenden Nukleinsäuremolekülen. 1999 folgte die revolutionäre Arbeit von Vogelstein und Kinzler, welche eine Methode entwickelten, bei der die Probe verdünnt und auf einzelne, Partitionen genannte Reaktionen aufgeteilt wurde. Nach der Amplifikation erfolgten Nachweis und Analyse einzelner Produkte mit Fluoreszenzsignal. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Begriff „digitale PCR“ geprägt, den wir heute alle kennen.

Über die Jahre wurden diese Methoden modernisiert und für eine breitflächige Adaptation kommerzialisiert. Die digitale PCR kann auf Mikrofluidik-Chips und -Tellern, auf Microarrays und in Mikrotröpfchen oder Tröpfchenkristallen auf Basis von Öl-Wasser-Emulsionen sowie neuerdings auch in qPCR-artigen Platten durchgeführt werden.

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Was ist digitale PCR?
Lernen Sie die Grundlagen der digitalen PCR, ihre Funktionsweise, eine Zusammenfassung ihrer Vorzüge und Grenzen sowie die Bandbreite der Applikationen kennen.
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Die Macht der digitalen PCR
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Finden Sie heraus, wie Sie von der Technologie profitieren können

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Die digitale PCR ist ein hochpräziser Ansatz zur sensitiven und reproduzierbaren Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren. Die Messungen werden nach Aufteilung der Probe in Partitionen vorgenommen, sodass in jeder Einzelreaktion entweder gar kein, nur ein oder mehrere Target-Moleküle vorliegen. Jede Partition wird im Anschluss an das Endpunkt-PCR-Thermocycling auf die Anwesenheit (positive Reaktion) oder Abwesenheit (negative Reaktion) eines Fluoreszenzsignals analysiert, woraus die absolute Anzahl der in der Probe vorliegenden Moleküle berechnet wird. Die Proben-Target-Quantifizierung erfolgt unabhängig von einer Standardkurve. Durch Eliminierung der Abhängigkeit von Standardkurven werden Fehler reduziert und die Präzision verbessert.

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Absolute Quantifizierung in 4 Schritten

Probenverdünnung und Pipettierung des PCR-Reaktionsgemischs
Probenverdünnung und Pipettierung des PCR-Reaktionsgemischs
Blau – TargetRot – Hintergrund (gDNA, cDNA; Primer/Sonden; Master-Mix)
Partitionierung einer PCR-Reaktion in Tausende von Einzelreaktionen
Partitionierung einer PCR-Reaktion in Tausende von Einzelreaktionen
Endpunkt-PCR-Amplifikation der Partitionen
Endpunkt-PCR-Amplifikation der Partitionen
Grün – positive ReaktionenBlau – negative Reaktionen
Auslesung und absolute Quantifizierung
Auslesung und absolute Quantifizierung
Teilen und gewinnen

Zwar wird die Probe genauso vorbereitet wie bei der qPCR, doch die Probenpartitionierung, bei der die Probe vor der Amplifikation in Tausende von Einzelreaktionen aufgeteilt wurde, ist ein Alleinstellungsmerkmal der digitalen PCR. Anders als bei der Massenanalyse in der qPCR wird bei der digitalen PCR durch zufällige Aufteilung der Moleküle in Partitionen der Effekt konkurrierender Targets minimiert, während zugleich die Präzision und Sensitivität des Nachweises seltener Targets steigen.

Sie erlaubt Forschern:

  • Die Quantifizierung in geringer Menge vorliegender Targets oder von Targets mit komplexem Hintergrund
  • Den Nachweis und die Unterscheidung von Allelvarianten (SNPs)
  • Die Überwachung geringfügiger Veränderungen der Target-Konzentration, die mittels qPCR nicht nachweisbar wären
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3 Hauptvorteile der Partitionierung

Steigert die effektive Konzentration
  • Verbessert die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD)
  • Amplifiziert und detektiert einzelne Target-Moleküle
Hat Anreicherungseffekt
  • Erhöht das Verhältnis von Target zu Hintergrund
Bietet überlegene Präzision und Linearität
  • Misst Einzelmoleküle statt einer Gesamtkonzentration
  • Je mehr Partitionen, desto höher die Präzision
  • Je mehr Partitionen, desto breiter der dynamische Bereich
Auswahl zwischen dPCR und qPCR
Stellen Sie die beiden Methoden einander gegenüber, um herauszufinden, welche Ihren Anforderungen am besten entspricht, und finden Sie heraus, wie Sie von Ihrem derzeitigen qPCR-Assay auf dPCR umsteigen.
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Poisson-Gesetz gibt der Partitionierung Bedeutung

Anders als die Real-time qPCR ist die digitale PCR nicht davon abhängig, dass in jedem Amplifikationszyklus die relative Menge an Target-Molekül bestimmt wird; stattdessen verlässt sie sich auf Poisson-Statistik zur Bestimmung der absoluten Target-Menge im Anschluss an eine Endpunkt-Amplifikation.

Da das Target-Molekül zufällig auf alle verfügbaren Partitionen verteilt ist, schätzt die Poission-Verteilung die durchschnittliche Anzahl an Molekülen je Partition (keines, eines oder mehrere) und berechnet die Kopien des Target-Moleküls je positiver Partition. Die statistische Poisson-Analyse der Anzahl positiver und negativer Reaktionen liefert eine präzise absolute Quantifizierung der Target-Sequenz.

Anwendung der Statistik zur absoluten Quantifizierung

In Experimenten mit digitaler PCR ist die absolute Quantifizierung von der zufälligen Verteilung der Target-Moleküle auf die Partitionen abhängig und die Daten sollten einer Poisson-Verteilung entsprechen. Die Poisson-Verteilung wurde 1837 nach dem französischen Mathematiker Siméon Denis Poisson benannt und wird angewendet, um die Wahrscheinlichkeit einer bestimmten Anzahl an Ereignissen in einem festgelegten Zeitraum zu ermitteln, wenn die Ereignisse mit einer bekannten konstanten Häufigkeit auftreten und unabhängig vom Eintreten des vorherigen Ereignisses sind.


Given: V alid pa r titions: 8000 Positive partitions: 4000 λ = −ln number of valid partitions ‒ number of positive partitions number of valid partitions λ = −ln 8000 ‒ 4000 8000 = 0.693 Calculated target copies per partition λ = −ln number of valid partitions ‒ number of positive partitions number of valid partitions Given: P a r tition volume is V = 0. 2 3 nl λ volume = λ V [µ l ] 1 000 = 3013 copies/µl Calculated target copies per µl λ volume = 0.693 0.23 x Simple mathematical computation of the Poisson law for a digital PCR experiment looks like this: λ is t h e expectation value for t h ese events and will tell what t h e most li k ely ave r age value of copies/pa r titions is Computing the estimated concentration of target genes in copies/µl
dPCR-Leitfaden für Anfänger
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Schnelle Antworten auf FAQs über die digitale PCR

Was ist der Unterschied zwischen absoluter und relativer Quantifizierung?
Absolute Quantifizierung mit digitaler PCR zählt schlicht und ergreifend die Anzahl der in einer Probe vorliegenden Moleküle. Es sind keine Standards erforderlich. Bei der absoluten Quantifizierung mithilfe der Standardkurve bei der qPCR werden die Unbekannten anhand einer bekannten Menge quantifiziert. Relative Quantifizierung verwendet eine Referenzprobe zum Vergleich und zur Bestimmung der Anzahl der ursprünglichen Exemplare an Template-DNA in der Reaktion von Interesse relativ zur Referenzprobe.
Was sind die Applikationen der PCR-Techniken?
Die Applikationen für PCR-Techniken umfassen die Bestimmung der An- oder Abwesenheit einer Target-Nukleinsäure, die Genotypisierung, die Quantifizierung der Genexpression, die Validierung von Assays, den Nachweis mikrobieller Targets, die Quantifizierung von NGS-Bibliotheken und weitere.
Wie genau ist die dPCR?
Die digitale PCR ist eine genaue Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren. Studien zeigen, dass dPCR die Präzision bei der Auflösung einer geringen Anzahl Kopien oder beim Zählen einzelner Moleküle deutlich verbessert, besonders bei Vorliegen von Inhibitoren oder Wildtyp-Populationen. Die digitale PCR weist verglichen mit der traditionellen qPCR eine niedrigere Nachweisgrenze und eine höhere laborinterne Reproduzierbarkeit auf.
Wie funktioniert dPCR?
Es wird Sie erleichtern, zu hören, das die anfängliche dPCR-Reaktion unter Verwendung bekannter Assay-Komponenten, wie sie auch in der qPCR zum Einsatz kommen, angesetzt wird. Dann jedoch erhalten Sie durch Diskretisierung oder Partitionierung jeder Probe in eine große Zahl an einzelnen und parallelen Reaktionen einige Partitionen mit einem oder mehreren Target-Molekülen, während andere vielleicht gar keines enthalten. Die Partitionierung kann durch Aufteilen der Probe auf Mikrotiterplatten mit Kapillaren oder Kanälen, Arrays aus Miniaturkammern oder in Form von Tropfen in einer Öl-Wasser-Emulsion erreicht werden. Bei jeder Partition erfolgt eine PCR-Amplifikation bis zum Endpunkt. Die Partitionen mit und ohne Amplifikationsprodukte werden einzeln ausgezählt. Jene, die Amplifikationsprodukte enthalten und ein Fluoreszenzsignal aufweisen, werden als positiv bezeichnet und mit „1“ bewertet, während jene ohne Amplifikationsprodukt, die nur ein Hintergrundsignal aufweisen, als negativ bezeichnet und mit „0“ bewertet werden. Anschließend wird eine statistische Poisson-Analyse durchgeführt, um die absolute Konzentration an Target zu berechnen, die in der ursprünglichen Probe vorhanden war. Dabei kommen keine Referenzen oder Standards zum Einsatz.
Welche Anwendungen können von der dPCR profitieren?
Anwendungen, die den Nachweis geringer Eingabemengen an Nukleinsäuren oder die feinere Auflösung der Target-Moleküle erfordern – so etwa der Nachweis seltener Ereignisse, die Analyse von Kopienzahlvariationen und die Genexpressionsanalyse der in geringer Menge vorhandenen Transkripte – können von dem Partitionierungseffekt der dPCR stark profitieren. Anwendungen wie Flüssigbiopsie, Einzelzellanalyse, NGS-Bibliotheksquantifizierung, Quantifizierung geringer Virus- und Bakterienlast, Analyse von Genediting-Ereignissen und GMO-Nachweis können ebenfalls die überragende Präzision und hohe Sensitivität, welche die digitale PCR von der qPCR abheben, gut nutzen. Für die meisten Forscher stellt die dPCR eine Ergänzung zur qPCR dar.
Welche Arten von Template können für die dPCR verwendet werden?
Sie können folgende Ausgangsmaterialien verwenden: aus Blut, Gewebe, Zellen, Tumoren, Zellkultur, Abstrichen und Spülungen isolierte genomische DNA, FFPE-DNA (formalinfixierte, in Paraffin eingebettete DNA), cfDNA (zirkulierende freie DNA), ctDNA (zirkulierende Tumor-DNA), mit Bisulfit behandelte DNA, Umwelt-DNA, cDNA, bakterielle DNA, virale DNA, Plasmid-DNA, Bibliotheks-DNA sowie synthetische DNA wie gBlocks und längere Oligonukleotide bis hin zu Gesamt-RNA, microRNA, lncRNA, viraler RNA, bakterieller RNA und in vitro transkribierter RNA.
Ist die digitale PCR das gleiche wie die digitale Tröpfchen-PCR?
Nein, denn „digitale PCR“ ist ein Überbegriff für alle digitalen PCR-Methoden, nicht nur die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR). Beispielsweise arbeitet die ddPCR mit Tröpfchen als Partitionen für die PCR-Probe, während andere digitale PCR-Methoden auf Mikrofluidik-Platten, Mikrofluidik-Chips oder anderen Prinzipien basieren.
Wie unterscheidet sich die digitale PCR von einer normalen PCR?
Das hängt von der Definition einer normalen PCR ab. Die Endpunkt-PCR ist für die qualitative oder semiquantitative Analyse von Nukleinsäuren auf Gelelektrophorese angewiesen. Die quantitative PCR (qPCR) kann anhand von Standardkurven Nukleinsäurekonzentrationen in Echtzeit messen. Die digitale PCR ermöglicht durch Kombination von Endpunkt-PCR mit Partitionierung und Statistik eine absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren.
Was ist ein digitaler PCR-Test?
Ein digitaler PCR-Test ist eine Methode zur absoluten Quantifizierung von Nukleinsäuren. Die PCR-Reaktion wird auf Tausende von Partitionen aufgeteilt, in welchen die Target-Nukleinsäure einzeln amplifiziert wird. Für den Nachweis der An- oder Abwesenheit von Produkten in den einzelnen Partitionen werden Fluoreszenzsonden oder -farbstoffe eingesetzt.
Was ist der Unterschied zwischen digitaler PCR und ddPCR?
Der Unterschied zwischen digitaler PCR und digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR) liegt in der Partitionierungsmethode. Bei der Nanoplatten-dPCR wird die Probe auf Tausende von Partitionen auf einer Mikrofluidik-dPCR-Platte aufgeteilt. Bei der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR) wird die Probe auf Tausende bis Millionen von Tröpfchen aufgeteilt, welche anschließend einzeln mit einem Tröpfchenmessgerät analysiert werden.
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