Wenn es bei der molekularbiologischen und Genomik-Forschung um die Quantifizierung von Nukleinsäuren geht, stehen Wissenschaftler häufig am Scheideweg. Welche Quantifizierungstechnik eignet sich besser, um die eigenen Forschungsziele möglichst effizient zu erreichen – die präzisere und robuste digitale PCR (digital PCR, dPCR) oder die standardisiertere und vertraute quantitative Real-time PCR (quantitative PCR, qPCR)? Die Wahl ist abhängig von der Applikation. Dieser Artikel bietet für alle Interessierten einen kurzen Einblick in die technische Evolution sowie praktische Applikationen dieser beiden PCR-Techniken.
Seit ihrer Erfindung im Jahr 1993 wissen Forscher die qPCR für ihre Geschwindigkeit, Sensitivität, Spezifität und Benutzerfreundlichkeit zu schätzen. Die Technik ist am nützlichsten zur Durchführung von Genexpressionsanalysen, SNP-Nachweisen, Genotypisierung oder allelischer Diskriminierung und zur Validierung von Mikroarray-Daten. Sorgfältig konzipierte qPCR-Assays können mehrere Kopien einer Target-Sequenz pro Reaktion nachweisen und ermöglichen damit einen breiten dynamischen Quantifizierungsbereich. Bei der Nachweischemie besteht die Auswahl zwischen interkalierenden Farbstoffen (SYBR Green) und Target-spezifischen Sonden (TaqMan, Molecular Beacons usw.).1 Die Kosten pro Probe sind hochflexibel und können mit Reaktionsvolumen, Durchsatz und Nachweismethode gesteuert werden, um spezifische Forschungsanforderungen zu erfüllen. Darüber hinaus steigerte die Publikation der MIQE-Richtlinien für die qPCR die Konsistenz zwischen Laboren und die experimentelle Reproduzierbarkeit.2
Bei Applikationen wie der Analyse von Kopienzahlvariationen oder dem Nachweis seltener Ereignisse, die eine besonders hohe Genauigkeit und Sensitivität erfordern, geriet die qPCR jedoch an ihre Grenzen. Bei derartigen Applikationen ist die dPCR der qPCR überlegen, da sie nicht nur die absolute Kopienzahl bestimmt, sondern durch Nachweis selbst subtiler Unterschiede und niedrig konzentrierter Targets auch über die Nachweisgrenzen hinausgeht. Anders ausgedrückt: Sie macht es möglich, die Nadel im Heuhaufen zu finden. Die digitale PCR hat die Anforderung einer Standardkurve eliminiert und eine geringere Anfälligkeit gegenüber Inhibitoren gezeigt, welche der Auslesung der Partitionen mittels Endpunkt-Fluoreszenz zu verdanken ist. Durch Eliminierung der systematischen Messabweichung bei der PCR-Effizienz wurden die Fehlerraten gesenkt – etwas, das die wissenschaftliche Community einstimmig anerkannte.3
Obwohl bereits in den frühen 1990er Jahren Methoden wie “PCR mit limitierender Verdünnung” oder “digitale PCR” bekannt wurden, wurde deren Fortschritt ironischerweise durch das Aufkommen der Real-time PCR aufgehalten.4,5 Warum? Grund war ein Mangel an Geräten und Chemie. Zum Glück zeigt ein aktuellerer Review ein vielversprechendes Bild von der Zukunft dieser Technologie.6 Die digitale PCR bietet einen unkomplizierten Alles-oder-Nichts-Ansatz, der in Kombination mit den kontinuierlichen technologischen Verbesserungen und der Publikation ihrer MIQE-Richtlinien in einem erneuten Aufflammen des Interesses an ihrem Potenzial.7 Heute wenden sich mehr und mehr Wissenschaftler für die Untersuchung von Mutationen in Krebsgenen, die Überwachung der Wirksamkeit von Immuntherapien, den Nachweis von Pathogenen, der Analyse von GMO, die Beurteilung der Häufigkeit von Genediting-Ereignissen und pränatale Tests auf Erbkrankheiten der dPCR zu und erweitern so den Umfang ihrer Applikationen.8
2. Bustin S.A. et al. Die MIQE Richtlinien: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: ein kurze Historie. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.
Seit ihrer Erfindung im Jahr 1993 wissen Forscher die qPCR für ihre Geschwindigkeit, Sensitivität, Spezifität und Benutzerfreundlichkeit zu schätzen. Die Technik ist am nützlichsten zur Durchführung von Genexpressionsanalysen, SNP-Nachweisen, Genotypisierung oder allelischer Diskriminierung und zur Validierung von Mikroarray-Daten. Sorgfältig konzipierte qPCR-Assays können mehrere Kopien einer Target-Sequenz pro Reaktion nachweisen und ermöglichen damit einen breiten dynamischen Quantifizierungsbereich. Bei der Nachweischemie besteht die Auswahl zwischen interkalierenden Farbstoffen (SYBR Green) und Target-spezifischen Sonden (TaqMan, Molecular Beacons usw.).1 Die Kosten pro Probe sind hochflexibel und können mit Reaktionsvolumen, Durchsatz und Nachweismethode gesteuert werden, um spezifische Forschungsanforderungen zu erfüllen. Darüber hinaus steigerte die Publikation der MIQE-Richtlinien für die qPCR die Konsistenz zwischen Laboren und die experimentelle Reproduzierbarkeit.2
Bei Applikationen wie der Analyse von Kopienzahlvariationen oder dem Nachweis seltener Ereignisse, die eine besonders hohe Genauigkeit und Sensitivität erfordern, geriet die qPCR jedoch an ihre Grenzen. Bei derartigen Applikationen ist die dPCR der qPCR überlegen, da sie nicht nur die absolute Kopienzahl bestimmt, sondern durch Nachweis selbst subtiler Unterschiede und niedrig konzentrierter Targets auch über die Nachweisgrenzen hinausgeht. Anders ausgedrückt: Sie macht es möglich, die Nadel im Heuhaufen zu finden. Die digitale PCR hat die Anforderung einer Standardkurve eliminiert und eine geringere Anfälligkeit gegenüber Inhibitoren gezeigt, welche der Auslesung der Partitionen mittels Endpunkt-Fluoreszenz zu verdanken ist. Durch Eliminierung der systematischen Messabweichung bei der PCR-Effizienz wurden die Fehlerraten gesenkt – etwas, das die wissenschaftliche Community einstimmig anerkannte.3
Obwohl bereits in den frühen 1990er Jahren Methoden wie “PCR mit limitierender Verdünnung” oder “digitale PCR” bekannt wurden, wurde deren Fortschritt ironischerweise durch das Aufkommen der Real-time PCR aufgehalten.4,5 Warum? Grund war ein Mangel an Geräten und Chemie. Zum Glück zeigt ein aktuellerer Review ein vielversprechendes Bild von der Zukunft dieser Technologie.6 Die digitale PCR bietet einen unkomplizierten Alles-oder-Nichts-Ansatz, der in Kombination mit den kontinuierlichen technologischen Verbesserungen und der Publikation ihrer MIQE-Richtlinien in einem erneuten Aufflammen des Interesses an ihrem Potenzial.7 Heute wenden sich mehr und mehr Wissenschaftler für die Untersuchung von Mutationen in Krebsgenen, die Überwachung der Wirksamkeit von Immuntherapien, den Nachweis von Pathogenen, der Analyse von GMO, die Beurteilung der Häufigkeit von Genediting-Ereignissen und pränatale Tests auf Erbkrankheiten der dPCR zu und erweitern so den Umfang ihrer Applikationen.8
Der Weg nach vorn
PCR-Technologien, ob nun Real-time oder digital, haben eine vielversprechende Zukunft vor sich. Während die qPCR weiterhin eine Standardanwendung im Labor bleibt, wird die dPCR mit ihrer verlockenden Sensitivität, Präzision, Robustheit und Reproduzierbarkeit Wissenschaftlern in Zukunft dabei helfen, die Grenzen des Möglichen zu verschieben. Mit der Einführung der topaktuellen Nanoplatten-basierten dPCR-Technologie können Labore, die den Umstieg auf Digital in Erwägung ziehen, von bemerkenswerten Multiplexierungs- und Durchsatz-Vorteilen profitieren. Industrie und wissenschaftliche Welt müssen sich dieser kompetitiven Umwelt anpassen und in der sich wandelnden Welt der PCR versuchen, die individuell perfekte Balance zu finden.Literatur
1. Deepak S.A. et al. Real-Time PCR: Revolutionizing detection and expression analysis of genes. Curr. Genom. 2007;8:234–251.2. Bustin S.A. et al. Die MIQE Richtlinien: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication-quality data. Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: ein kurze Historie. Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: A technology review. Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR Experiments. Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.