Der neue Standard in der PCR – digitale PCR

Kurz gefasst wird die digitale PCR für die folgenden Zwecke eingesetzt: Nachweis von seltenen Sequenzen, Kopienzahlvariationen und mikrobiellen Targets; Quantifizierung seltener Mutationen, einschließlich aus Flüssigbiopsien; Einzelzellanalyse; Messung der Viruslast; Analyse der Genexpression; Quantifizierung von Next Generation Sequencing(NGS)-Bibliotheken und vieles anderes.

Der Unterschied zwischen PCR und digitaler PCR besteht darin, dass die Endpunkt- oder herkömmliche PCR qualitative oder semiquantitative Analysen bietet, während die dPCR eine absolute Quantifizierung ermöglicht. Die digitale PCR ist schneller, präziser und reproduzierbarer, sie bietet Multiplexing-Fähigkeiten, erfordert aber auch eine größere anfängliche Investition.

Zu den Vorteilen der digitalen PCR gehören die absolute Target-Quantifizierung ohne Standards oder Referenzkurven, eine hohe Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren, eine zum Nachweis geringfügiger Änderungen erforderliche hohe Präzision, eine hohe Sensitivität, eine niedrige Nachweisgrenze und eine hohe Reproduzierbarkeit, insbesondere zwischen verschiedenen Laboren.

Zu den Nachteilen der digitalen PCR zählen ein leicht schmalerer dynamischer Bereich als bei der qPCR. Die Methode ist nicht ideal für große Amplifikate geeignet.

Die QIAcuity Gerätesoftware lässt die Messung und Verarbeitung einer Platte ohne Versiegelung nicht zu. Wenn Sie einen Trockenlauf durchführen möchten, verwenden Sie bitte eine versiegelte Platte und richten Sie diese Platte in der QIAcuity Software Suite ein.

Die Genauigkeit der digitalen PCR variiert zwischen den verschiedenen dPCR-Systemen und -Applikationen. Eine Vergleichsstudie der Präzision und Sensitivität von dPCR vs. qPCR ergab, dass die dPCR die Standardabweichung von Replikaten um das Dreifache senkt. Hinsichtlich der Sensitivität beim Mutationsnachweis ist bei der qPCR ab einer Mutationsrate von 10 % keine zuverlässige Quantifizierung mehr möglich, bei der dPCR ab einer Mutationsrate von 0,1 %.

Der Name „digitale PCR“ kommt daher, dass die Methode binäre Ein-/Aus- oder Ja-/Nein-Ergebnisse liefert. Digitale Assays können nur zwischen zwei Signalen unterscheiden und nicht zwischen einer Reihe von von Möglichkeiten. So sind die Dinge entweder schwarz oder weiß statt „50 shades of grey“. Speziell bei der dPCR unterscheidet der Sensor zwischen einer positiven und negativen Partition und liefert ein Ja oder Nein als Antwort auf die Frage, ob das Target in der Partition vorhanden ist.

Unsere QIAcuity Systeme für die digitale PCR arbeiten mit einer Nanoplatten-basierten Technologie und bieten damit signifikante Vorteile gegenüber der Technologie der tröpfchenbasierten digitalen PCR (droplet digital PCR, ddPCR). In die dPCR-Nanoplatte fest integrierte Partitionen verhindern Variationen bei Größe und Koaleszenz, wie sie bei der ddPCR beobachtet werden. Abgesehen davon führt die gleichzeitige Auslesung aller Probenpartitionen in Nanoplatten schneller zum Ergebnis. Nanoplatten sind nicht nur anwenderfreundlich und genau wie die qPCR leicht zu pipettieren, sondern auch für die Front-End-Automation geeignet. Am wichtigsten ist die Tatsache, dass ordnungsgemäß versiegelte Nanoplatten eine Probenverdunstung und Kontaminationen von Well zu Well verhindern. Partitionierung, Thermocycling und Bildgebung sind in einem vollautomatisierten Gerät integriert, das Ergebnisse in weniger als zwei Stunden liefert – anders als einige andere digitale PCR-Systeme, die mehr als vier Stunden benötigen. Darüber hinaus machen skalierbare Konfigurationen und die höhere Multiplexierungsfähigkeit die Anpassung der digitalen PCR mit QIAcuity an alle Arten von Laboren und Applikationsanforderungen möglich. Mithilfe der QIAcuity Software Suite können digitale PCR-Experimente, Proben sowie Reaktionsgemische definiert, Nanoplatten zugewiesen und an das QIAcuity Gerät übertragen werden. Nach dem Lauf können Daten analysiert, Berichte erstellt und Daten für die Remote-Analyse exportiert werden.

Die QIAcuity Gerätesoftware lässt die Messung und Verarbeitung einer Platte ohne Versiegelung nicht zu. Wenn Sie einen Trockenlauf durchführen möchten, verwenden Sie bitte eine versiegelte Platte und richten Sie diese Platte in der QIAcuity Software Suite ein.

Unsere QIAcuity Systeme für die digitale PCR arbeiten mit einer Nanoplatten-basierten Technologie und bieten damit signifikante Vorteile gegenüber der Technologie der tröpfchenbasierten digitalen PCR (droplet digital PCR, ddPCR). In die dPCR-Nanoplatte fest integrierte Partitionen verhindern Variationen bei Größe und Koaleszenz, wie sie bei der ddPCR beobachtet werden. Abgesehen davon führt die gleichzeitige Auslesung aller Probenpartitionen in Nanoplatten schneller zum Ergebnis. Nanoplatten sind nicht nur anwenderfreundlich und genau wie die qPCR leicht zu pipettieren, sondern auch für die Front-End-Automation geeignet. Am wichtigsten ist die Tatsache, dass ordnungsgemäß versiegelte Nanoplatten eine Probenverdunstung und Kontaminationen von Well zu Well verhindern. Partitionierung, Thermocycling und Bildgebung sind in einem vollautomatisierten Gerät integriert, das Ergebnisse in weniger als zwei Stunden liefert – anders als einige andere digitale PCR-Systeme, die mehr als vier Stunden benötigen. Darüber hinaus machen skalierbare Konfigurationen und die höhere Multiplexierungsfähigkeit die Anpassung der digitalen PCR mit QIAcuity an alle Arten von Laboren und Applikationsanforderungen möglich. Mithilfe der QIAcuity Software Suite können digitale PCR-Experimente, Proben sowie Reaktionsgemische definiert, Nanoplatten zugewiesen und an das QIAcuity Gerät übertragen werden. Nach dem Lauf können Daten analysiert, Berichte erstellt und Daten für die Remote-Analyse exportiert werden.

Wenn Sie das QIAcuity dPCR-Gerät für acht Platten verwenden, können Sie bis zu 312 Proben in 24-Well-Nanoplatten und bis zu 1248 Proben in 96-Well-Nanoplatten analysieren. Weitere Informationen finden Sie hier.