HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits

• Präparationsdauer etwa 50 Minuten
• Lysatbereinigung und Isopropanolausfällung ohne Zentrifugation
• Kein Risiko des Verlusts von DNA-Pellets beim Ausfällen
• Bis zu 10 mg Ausbeute an Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl
• LyseBlue zur optimalen Lyse und maximalen DNA-Ausbeute
• Endotoxinentfernung inbegriffen (<0,04 EU/μg DNA)

HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits bieten eine vakuumbasierte Plasmid-DNA-Präparation im Großmaßstab auf Anionenaustauschbasis und benötigen zur Elution der finalen Plasmid-DNA nur einen Zentrifugationsschritt. Die aufgereinigte DNA entspricht der durch zweimalige CsCl-Gradientenzentrifugation gewonnenen DNA und eignet sich für transfektionsfähige Anwendungen. Für das Protokoll wird ein QIAvac HiSpeed LS Vakuumverteiler benötigt.

Die HiSpeed EF Mega Giga Kits müssen zusammen mit dem QIAvac HiSpeed LS verwendet werden.

HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits enthalten QIAfilter Cartridges, HiSpeed Tips und QIAconcentrator-Module für die schnelle großtechnische Plasmidpräparation mit Vakuumverteiler. Das vakuumgetriebene QIAfilter-Modul ersetzt den Zentrifugationsschritt im klassischen Anionenaustauschverfahren und beschleunigt und vereinfacht so die Aufreinigung. Der QIAconcentrator liefert hochkonzentrierte DNA durch Zentrifugation nach Ethanolausfällung. Aus 500 ml bzw. 2,5 l Kulturmedium können bis zu 2,5 mg (Mega) bzw. 10 mg (Giga) Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl aufgereinigt werden (das Kulturvolumen hängt von der Plasmid-Kopienzahl, der Größe des Inserts, dem Wirtsstamm und dem Kulturmedium ab). Der Aufbau der HiSpeed Tips ermöglicht eine sehr hohe Durchflussrate, so dass die DNA-Bindung, das Waschen und die Elutionsschritte für die Plasmidaufreinigung schneller erfolgen können. Die durch HiSpeed gewonnene Plasmid-DNA ist endotoxinfrei (<0,04 EU/µg DNA).

Das einzigartige Anionenaustauscherharz in den HiSpeed Tips wurde exklusiv für die Aufreinigung von Nukleinsäuren entwickelt. Seine hervorragenden Trenneigenschaften führen zu einer DNA-Reinheit, die der durch zwei aufeinanderfolgende Durchgänge der CsCl-Gradientenzentrifugation erzielten Reinheit gleichwertig oder überlegen ist. HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits entfernen während des Lyseschrittes freigesetzte bakterielle Endotoxine, welche die Transfektion der DNA in Primärzellen und sensitive Kulturzellen beeinflussen. Die aus den HiSpeed Plasmid Mega/Giga EF Kits gewonnene endotoxinfreie DNA eignet sich hervorragend für reproduzierbare und zuverlässige Transfektionsresultate. Die QIAGEN ultrareine endotoxinfreie DNA ist auch für die Gentherapie-Forschung und andere sensible Applikationen geeignet.

QIAfilter Cartridges (siehe Abbildung „ QIAfilter Mega-Giga Cartridge“) sind spezielle Filtereinheiten, die den Zentrifugationsschritt nach der alkalischen Lyse von Bakterienzellen ersetzen können. QIAfilter Cartridges entfernen SDS-Niederschlag vollständig und bereinigen Bakterienlysate in einem Bruchteil der für die Zentrifugation benötigten Zeit. Die vorverpackten HiSpeed Tips arbeiten nach dem Schwerkraftprinzip und trocknen nie aus, was den Zeitaufwand für die manuelle Plasmidpräparation minimiert.

Der einzigartige QIAconcentrator (siehe Abbildung „ HighSpeed Plasmid Giga EF-Verfahren“) ersetzt den Zentrifugationsschritt, mit dem traditionell die mit Isopropanol ausgefällte DNA nach der Aufreinigung gewonnen wird. Das QIAconcentrator-Modul fängt die ausgefällte DNA auf, während das Isopropanol-Puffergemisch durch das Modul fließt. Die DNA wird dann einfach aus dem QIAprecipitator in ein Entnahmeröhrchen mit TE-Puffer oder Wasser eluiert. Dieses spezielle Modul eliminiert auch das Risiko des Pelletverlustes, zu dem es beim Abgießen des Überstandes nach der Zentrifugation kommen kann.

Endotoxine, auch bekannt als Lipopolysaccharide oder LPS, sind Bestandteile der Zellmembran gramnegativer Bakterien wie E. coli (siehe Abbildung „ Bakterienzellwand“). Die Lysephase der Plasmidaufreinigung setzt Endotoxine frei, die bei endotoxinempfindlichen Zelllinien die Effizienz der Transfektion erheblich verringern. Zudem können Endotoxine die Aufnahme von Plasmid-DNA in Transfektionsexperimenten beeinflussen, da sie mit der DNA um „freies“ Transfektionsreagenz konkurrieren.

Endotoxine lösen auch eine unspezifische Aktivierung von Immunreaktionen in Immunzellen wie Makrophagen und B-Zellen aus, was zu falscher Interpretation der Transfektionsergebnisse führen kann. Zu diesen Folgen gehört die induzierte Synthese von Proteinen und Lipiden wie IL-1 und Prostaglandin. Insgesamt stellen Endotoxine beim Aufbau von Transfektionsexperimenten eine nicht beeinflussbare Variable dar, die das Resultat und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflusst und deren Vergleich und Interpretation erschwert. In der Gentherapieforschung können Endotoxine durch Auslösung des endotoxischen Schocksyndroms und Aktivierung der Komplementkaskade zu Beeinträchtigungen führen. >

Neutralisierte Bakterienlysate werden in der QIAfilter Cartridge inkubiert und in Sekundenschnelle durch Vakuum aufgereinigt. Zu diesem Zeitpunkt wird dem gefilterten Lysat der Puffer zur Endotoxinentfernung zugesetzt. Eine Inkubation ist nicht erforderlich. Das Filtrat wird zur Aufreinigung der Plasmid-DNA auf eine HiSpeed-Tip gegeben (siehe Abbildung „ HighSpeed Plasmid Giga EF-Verfahren“). Die eluierte DNA wird mit Isopropanol vermischt und unter Vakuum in den QIAconcentrator überführt und gewaschen. Die konzentrierte und entsalzte DNA wird dann aus dem QIAconcentrator direkt in ein frisches Entnahmeröhrchen mit TE-Puffer oder Wasser eluiert.

Mit HiSpeed Plasmid Mega and Giga EF Kits aufgereinigte DNA liefert hervorragende Ergebnisse bei allen Anwendungen, von der Klonierung und Sequenzierung bis zur Transfektion von sehr empfindlichen Zellen und Primärzellen und dem plasmidvermittelten Gen-Silencing.