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Digitale PCR

dPCR vs. qPCR

Beim Vergleich zwischen dPCR- und qPCR-Technologien ist der entscheidende Unterschied die Präzisionsleistung. Während beide eine hochsensitive und zuverlässige Nukleinsäuredetektion und -quantifizierung bieten, lässt sich der Hauptunterschied zwischen den beiden Technologien am besten anhand des Vergleichs von Analogradio und Digitalradio beschreiben, so Dr. Jim Hugget, Principal Scientist, National Measurement Laboratory. „Bei einem Analogradio muss zunächst das Einstellrad fein abgestimmt werden, um bei möglichst geringen Störungen die gewünschte Station zu erreichen. Trotzdem hängt die Qualität vom Empfang ab und das Signal unterliegt Störungen durch Rauschen. Das entspricht der qPCR. Sie ist zuverlässig, erfordert aber eine Optimierung, um gute Ergebnisse zu erhalten. Selbst dann ist Hintergrundrauschen unvermeidlich. Beim Digitalradio wird einfach die Station aufgerufen und sie ist entweder mit einem klaren Signal verfügbar oder eben nicht. Genauso ist es bei der dPCR, die präzise, binäre Ergebnisse liefert. Sie zählt wortwörtlich die An- oder Abwesenheit von DNA-Molekülen. Die Klarheit der Ergebnisse, kombiniert mit einer geringeren Fehlerrate, sorgt für eine unglaublich hohe Präzision. Die digitale PCR ist sehr gut zur Messung kleinerer quantitativer Unterschiede geeignet.“

Vergleich und Gegenüberstellung: qPCR vs. dPCR

Forscher schätzen die qPCR wegen ihrer Geschwindigkeit, Sensitivität, Spezifität und Benutzerfreundlichkeit. Die Technik ist am nützlichsten zur Durchführung von Genexpressionsanalysen, für den Pathogennachweis und Mikrobiom-Analysen sowie zur Validierung von Mikroarray-Daten. Bei Anwendungen, die eine herausragende Genauigkeit und Sensitivität erfordern, wie der Analyse von Kopienzahlvariationen oder dem Nachweis von Mutationen und SNPs und der Allelunterscheidung, gerät die qPCR jedoch an ihre Grenzen. Bei derartigen Anwendungen ist die dPCR der qPCR überlegen, da sie nicht nur die absolute Kopienzahl bestimmt, sondern auch die Einschränkungen der Nachweisgrenzen überwindet, d. h. sie ist in der Lage, geringfügige Unterschiede in Form von 10 % Präzision und Mutationsraten < 1 % nachzuweisen.

Dank Probenpartitionierung und Endpunkt-Thermocycling ermöglicht die digitale PCR auch eine robuste Quantifizierung, d. h. eine hohe Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren und eine geringere Beeinflussung durch Änderungen der PCR-Effizienz.

Real-time PCR/qPCR Digitale PCR
Quantitativ, relativ oder absolut, aber Standardkurven
oder Referenzproben sind erforderlich
Quantitativ, absolut und keine Standards
oder Referenzen erforderlich

Massen-PCR

  • flexible Reaktionsvolumen
  • beeinflusst durch Änderungen der PCR-Effizienz,
    da die Daten in der exponentiellen Phase erfasst werden
  • anfällig für Inhibitoren

Probenpartitionierung

  • höhere Toleranz gegenüber
    Inhibitoren/gesteigerte Robustheit
  • nicht beeinflusst durch Änderungen
    der Amplifikationseffizienz
  • höhere statistische Aussagekraft
    dank Poisson-Statistik
Misst PCR-Amplifikation in jedem Zyklus Misst nach Abschluss der PCR-Zyklen
Detektiert Mutationsraten > 1 % Detektiert Mutationsraten von ≥ 0,1% (hohes
Signal-zu-Rauschen-Verhältnis)
Gut etablierte Protokolle Höhere Präzision für höhere Reproduzierbarkeit
von Labor zu Labor

qpcr vs dpcr heparin
dPCR-Reaktionen bleiben auch in Gegenwart von Inhibitoren wie Huminsäure und Heparin robust. qPCR- (auf Rotor-Gene Q) und dPCR-Reaktionen (auf QIAcuity) wurden in Gegenwart angegebener Mengen an Inhibitoren mit dem entsprechenden QIAcuity PCR-Master-Mix (EvaGreen) und mit identischen Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Quantifizierung zeigt Cq (qPCR) oder Kopien/µl (dPCR) als relative Unterschiede zwischen den Proben, wobei die nicht inhibierte Probe auf 100 % gesetzt wird.
digital pcr vs qpcr humic acid
dPCR-Reaktionen bleiben auch in Gegenwart von Inhibitoren wie Huminsäure und Heparin robust. qPCR- (auf Rotor-Gene Q) und dPCR-Reaktionen (auf QIAcuity) wurden in Gegenwart angegebener Mengen an Inhibitoren mit dem entsprechenden QIAcuity PCR-Master-Mix (EvaGreen) und mit identischen Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Quantifizierung zeigt Cq (qPCR) oder Kopien/µl (dPCR) als relative Unterschiede zwischen den Proben, wobei die nicht inhibierte Probe auf 100 % gesetzt wird.
qpcr vs dpcr precision
1 Cq in der qPCR, was für 50 % Präzision steht, ist gleichbedeutend mit 10 % Präzision in dPCR und entspricht einer 2-fachen Konzentrationssteigerung.

Wann ist dPCR und wann qPCR einzusetzen?

Wenn es bei der molekularbiologischen und Genomik-Forschung um die Quantifizierung von Nukleinsäuren geht, stehen Wissenschaftler häufig am Scheideweg. Welche Quantifizierungstechnik eignet sich besser, um die eigenen Forschungsziele möglichst effizient zu erreichen – die präzisere und robuste digitale PCR (dPCR) oder die standardisiertere und vertraute quantitative Real-time PCR (qPCR)? Beide Technologien haben Gemeinsamkeiten, aber auch jeweils eigene Vorzüge und Einschränkungen, die die Entscheidung anwendungsabhängig machen.

Das Anwendungsraster gibt den Grad der Eignung jeder Technologie für einige der gängigsten Anwendungen an.

Die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), eine der frühesten Formen der digitalen PCR, wies für die meisten der oben aufgeführten Applikationen bereits Vorzüge gegenüber der qPCR auf. Beim Vergleich ddPCR vs. qPCR eignet sich die qPCR für Applikationen, die einen breiten dynamischen Bereich erfordern, wohingegen die ddPCR für Applikationen zu bevorzugen ist, die eine höhere Präzision oder die Analyse der fraktionierten Abundanz erfordern.

Die Entwicklung von der ddPCR zur Nanoplatten-dPCR hat den Anwendungsbereich dieser Technologie erweitert, sodass nun noch mehr Applikationen möglich sind. Der Workflow der Nanoplatten-dPCR ist dank gleichzeitiger Auslesung aller Probenpartitionen, Front-End-Automation und der einfachen Platteneinrichtung ähnlich wie bei der qPCR deutlich schneller. Durch diese zusätzliche Geschwindigkeit eignet sich die Technologie für Screening- und Hochdurchsatz-Applikationen, ohne dass Abstriche bei Präzision, Genauigkeit und Sensitivität erforderlich sind.

Finden Sie heraus, was die dPCR für Sie tun kann
Die digitale PCR und insbesondere die Nanoplatten-basierte Technologie von QIAGEN machen es möglich, völlig neue Fragestellungen zu beantworten, wodurch sie für eine breite Palette an Anwendungen geeignet ist.
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Wie unterscheidet sich der bei der dPCR verwendete Assay von dem Assay bei der qPCR?
Alle Regeln für das ordnungsgemäße Real-time PCR-Assay-Design gelten auch für die dPCR. Ein Assay, der gut mit Real-time PCR funktioniert, wird dies höchstwahrscheinlich auch mit dPCR tun. Der Übergang von SYBR-Assays zur EvaGreen-dPCR ist einfach. Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass die empfohlenen Zyklusbedingungen und Primer-/Sondenkonzentrationen für die dPCR ausgewählt werden, wie sie in den entsprechenden QIAcuity dPCR Kits beschrieben sind. Zur schnellen Optimierung von Assays, die suboptimale Ergebnisse liefern, durch Ausführung eines Temperaturgradienten in den Annealing-Schritten, können die QIAcuity Master-Mixes auch auf jedem beliebigen Real-time PCR-Gerät analysiert werden. Detaillierte Hinweise zum Assay-Design finden Sie in unserem QIAcuity Application Guide .
Was ist der Unterschied zwischen qPCR und dPCR?

Der Unterschied zwischen qPCR und dPCR liegt darin, wie die Methoden Nukleinsäuren quantifizieren. qPCR misst die Amplifikation, während sie stattfindet, und nutzt Standardkurven, um die Menge der Nukleinsäure in der Probe zu bestimmen. dPCR unterteilt die Probe in Tausende von Partitionen, erfasst die Daten am Ende jeder Reaktion und nutzt Statistik, um die absolute Anzahl an Molekülen in jeder Reaktion zu ermitteln.

Worin unterscheiden sich digitale PCR und RT-qPCR?
Der Unterschied zwischen digitaler PCR und RT-qPCR ist die Quantifizierungsmethode. Bei jeder RT-PCR erfolgt die reverse Transkription einer RNA-Probe in cDNA, welche dann in einer PCR-Reaktion amplifiziert wird. Bei der RT-qPCR wird die cDNA anhand von Standardkurven in Echtzeit quantifiziert. Bei der RT-dPCR wird die cDNA am Ende der Reaktion gemessen und Poisson-Statistik angewendet, um eine absolute Quantifizierung zu erreichen. Beide Methoden können zur Analyse von RNA und der Genexpression eingesetzt werden.
Erfordert die dPCR eine Standardkurve?
Bei der dPCR wird die absolute Konzentration an Zielmolekülen in der Endpunkt-Reaktion gemessen. Die Konzentrationen unbekannter Größen können anhand der beobachteten dPCR-Ergebnisse (Anzahl Negative, Anzahl Positive und analysiertes Partitionsvolumen) bestimmt werden.
Was sind die Vorteile der digitalen PCR gegenüber der qPCR?
Die digitale PCR wird der qPCR häufig vorgezogen, da die dPCR keine Kalibrierungskurven erfordert und nicht durch Unterschiede zwischen Kalibriersubstanz und Probe beeinflusst wird. Die digitale PCR hat eine hohe PCR-Effizienz, ist sehr präzise und eignet sich für den Nachweis seltener Targets vor einem hohen Hintergrund aus Nicht-Target-DNA. dPCR ist darüber hinaus weniger anfällig für PCR-Inhibitoren als qPCR.
Wofür wird qPCR verwendet?

Die qPCR wird unter anderem für folgende Zwecke eingesetzt: Nachweis von seltenen Mutationen (ctDNA), seltenen Sequenzen (Virus- und Bakterienlast, miRNA) und Kopienzahlvariationen, Quantifizierung der Genexpression, SNP-Genotypisierung, Verifizierung von Microassays, Validierung von Assays, Nachweis von Pathogenen und Quantifizierung von NGS-Bibliotheken.

Was ist qPCR und wie funktioniert sie?
Die quantitative PCR (qPCR) ist eine Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren. qPCR arbeitet durch Messung der DNA-Amplifikation in Echtzeit mittels Überwachung der Fluoreszenz. An einem bestimmten Punkt nimmt die Fluoreszenzintensität proportional zur anfänglichen Anzahl der Template-Nukleinsäuren in der Probe zu. Die Menge der Target-DNA wird mit einer Kalibrierungskurve berechnet, die anhand von Verdünnungsreihen eines Standards mit bekannten Konzentrationen erstellt wurde.
Wo liegt der Nachteil der qPCR?
Der Nachteil der qPCR besteht darin, dass die Methode auf Standardkurven angewiesen ist. Dieses Erfordernis kostet Zeit und Ressourcen und wirkt sich negativ auf die PCR-Effizienz aus. Die qPCR-Methode ist weniger präzise, weniger reproduzierbar und anfälliger für PCR-Inhibitoren und Kontaminanten als die dPCR.
Kann ich den dPCR-Master-Mix zu Optimierungszwecken in einem qPCR-Thermocycler verwenden?
Der dPCR-Master-Mix kann in der qPCR eingesetzt werden, um Proben- und/oder Primer-/Sondenkonzentration zu optimieren, bevor der Assay von der qPCR auf die dPCR umgestellt wird.