PCR & DNA-Amplifikation

Die Taq-DNA-Polymerase gehört zur Polymerasefamilie A, einer Gruppe verwandter Enzyme, die bakterielle Reparaturpolymerasen und die meisten replikativen Polymerasen von Bakteriophagen umfasst. Die Polymerasen der Familie A weisen meist sowohl replikative als auch Reparaturaktivitäten auf. Die wichtige Funktion des „Korrekturlesens“, die die Reparatur eines falsch gepaarten Nukleotids ermöglicht, wird durch die 3’→5’-Exonuklease-Aktivität gewährleistet, während die 5’→3’-Exonuklease-Aktivität die Beseitigung von RNA-Primern ermöglicht. In der Taq-Polymerase wurde die 3’→5’-Exonuklease-Korrekturlesedomäne verändert und ist nicht mehr funktionsfähig.

Die PCR stellt dieselben grundlegenden Anforderungen an eine Polymerase wie eine Zelle an ihr Replikationssystem: Zuverlässigkeit, Präzision oder Genauigkeit, Geschwindigkeit und Prozessivität. Die Präzision, oder Genauigkeit, der Polymerase bezieht sich auf den Einbau der korrekten Nukleotide gemäß den Vorgaben des Templatestrangs. Durch eine Reihe von molekularen Kontrollpunkten am Ort des Nukleotideinbaus gewährleisten die DNA-Polymerasen die genaue Replikation. Die Standard-Taq-Polymerase ist recht genau und hat eine relativ niedrige Gesamtfehlerrate, verfügt aber nicht über die durch die 3’→5’-Exonuklease vermittelte „Korrekturleseaktivität“, was die effektiv mögliche Amplifikatgröße des Enzyms begrenzt. Taq ist ein robustes, leicht zu optimierendes Enzym, das am besten für Amplifikation von DNA-Fragmenten < 2 kb geeignet ist. Das Enzym kann für Fragmente von bis zu 3–4 kb eingesetzt werden, jedoch sinkt die Effizienz schnell bei Amplifikaten mit einer Länge von mehr als etwa 3 kb.

Die Hot-Start-PCR wird durch Modifikationen an der DNA-Polymerase ermöglicht, die durch Inaktivierung des Enzyms die Amplifikation blockieren, bis eine höhere Temperatur erreicht ist. Zu den gängigen Modifikatoren gehören die Interaktion mit Antikörpern, die chemische Modifizierung und die Aptamer-Technologie. Werden die zulässigen Reaktionstemperaturen während der PCR-Zyklen erreicht, dissoziiert der Inhibitor von der Polymerase und die Polymerisation beginnt.

Durch Bindung an die Polymerase inaktivieren Enzym-gebundene Anti-Taq-DNA-Polymerase-Antikörper das Enzym und verhindern so eine frühe DNA-Amplifikation bei niedrigeren Temperaturen. Sobald die optimale Annealing-Temperatur erreicht ist, beginnt der Abbau und die Dissoziation der Antikörper, wodurch die Taq-DNA-Polymerase in die Reaktion freigesetzt wird und der Amplifikationsprozess beginnen kann.

Chemisch modifizierte Taq-DNA-Polymerasen haben hitzelabile Blockierungsgruppen, die an bestimmte Aminosäurereste gebunden sind. Diese werden durch einen ersten Aktivierungsschritt bei hoher Temperatur in der PCR-Reaktion entfernt. Dadurch wird die volle Aktivität der Taq-DNA-Polymerase wiederhergestellt und die PCR kann fortgesetzt werden.
Die Aptamer-vermittelte Hot-Start-PCR beruht auf der Funktionshemmung der Taq-DNA-Polymerase durch die Anlagerung von Oligonukleotid-Aptameren. Aptamere dissoziieren bei einer niedrigeren Temperatur als hitzelabile chemische Blockierungsgruppen oder Antikörper vom Enzym, wodurch ein Aktivierungsschritt bei hoher Temperatur überflüssig wird und PCR-Protokolle beschleunigt werden. Darüber hinaus ist die Aptamer-basierte Hemmung vollständig reversibel, so dass die Aktivität der Taq-DNA-Polymerase auch am Ende des Thermozyklus blockiert wird.