illustration of people in lab coats working on dna

PCR

Zelllinien-Engineering

Trotz Fortschritten bei CRISPR und anderen Technologien zum Zell-Engineering bleibt der Weg von der Ausgangs- bis zur modifizierten Zelle lang und schwierig. Was wäre, wenn es eine Möglichkeit gäbe, Ihren Workflow zur Zelllinienentwicklung zu verbessern, zu beschleunigen und gleichzeitig unbeabsichtigte Veränderungen am Genom zu identifizieren?

Übersicht

Die Schwachstellen des Zelllinien-Engineering
  • Aufgrund der niedrigen Erfolgsrate von Geneditierungstechniken kann es mehrere Monate dauern, bis das Screening auf erfolgreich editierte Klone und die Charakterisierung der Editierungen abgeschlossen sind.
  • Geneditierung, Virustransduktion und selbst Routine-Transfektionen können Off-Target-Effekte wie Chromosomen-Rearrangements und strukturelle Varianten verursachen, die durch klassische Methoden wie Karyotypisierung und FISH häufig übersehen werden.
Eine Woche für:
Eine Woche für:
  • Transfektion
  • Transduktion
  • CRISPR-Geneditierung
Mehrere Monate für:
Mehrere Monate für:
  • Klonauswahl
  • Sanger-Sequenzierung
  • qPCR-Validierung
  • Genexpressionsanalyse
CRISPR und QuantiNova Kits
Mehrere Wochen für:
Mehrere Wochen für:
  • Beurteilung der Genomintegrität
  • Off-Target-Analyse
  • RNA-Sequenzierung
Epitect HI-C Kit
Geschwindigkeit und Qualität müssen sich nicht ausschließen – kombinieren Sie beide in Ihrem Workflow zur Klonauswahl und Zellliniencharakterisierung
Cell line developement benefits illustration

Klonauswahl und -anreicherung

Hält das CRISPR-Screening Sie über Wochen beschäftigt?

Streichen Sie unnötige Aufgaben aus Ihrer Charakterisierung von CRISPR-Geneditierungen. Sehen Sie sich das Video an und erfahren Sie, wie.


So charakterisieren Sie Ihre CRISPR-Geneditierungen schneller und einfacher
Nehmen Sie eine 3x schnellere Route zu Ihrem relevanten Klon

Charakterisieren Sie CRISPR-Geneditierungen in 3 Tagen mit nur 10 Zellen/µl. 

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Genexpressionsanalyse – Validieren von Geneditierungen auf Transkriptebene mit QuantiNova PCR
person working in lab
Führen Sie eine qPCR direkt anhand von Zellen durch

Minimieren Sie die Zeit und den Aufwand, die zur Identifizierung Ihres relevanten Klons erforderlich sind.

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Sind Sie bereit, Ihren Workflow zur Klonselektion zu beschleunigen?
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Zellliniencharakterisierung

Ermitteln Sie den tatsächlichen Genomstatus innerhalb von 5 Tagen
Schauen Sie sich dieses Video an und entdecken Sie einen einfachen, aber eleganten Ansatz, nach unbeabsichtigten Genomveränderungen in Ihren modifizierten Zellen zu suchen.
Identifizieren Sie Chromosomenveränderungen frühzeitig im Prozess der Zelllinienentwicklung
Warum EpiTect Hi-C anstelle von Karyotypisierung oder FISH? 

Verglichen mit klassischen Methoden liefert Ihnen EpiTect Hi-C einen 10x präziseren Einblick in das Genom, bei dem Blind Spots im Genom wie Chromosomen-Rearrangements und strukturelle Varianten erkannt werden.  Erfahren Sie mehr in diesem Flyer.  

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beware of blind spots illustration
Kommen Sie unbeabsichtigten Änderungen, die sich in Ihren Zellen verbergen, zuvor
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Häufig gestellte Fragen

CRISPR-Screening
Gibt es bei der Verarbeitung von Kulturzellen auf beschichteten Kulturschalen etwas zu beachten? Sind zusätzliche Aufreinigungsschritte erforderlich, um Beschichtungsreagenzien wie Poly-L-Lysin zu beseitigen oder zu reduzieren?
Die Probenvorbereitung und Target-Amplifikation mit QIAprep&amp CRISPR werden durch Beschichtungreagenzien nicht beeinträchtigt. Zusätzliche Informationen und eine Liste der getesteten Beschichtungsreagenzien finden Sie im QIAprep&amp CRISPR und CRISPR-Q Custom Kits Handbuch in Anhang C.
Gibt es beim Arbeiten mit transduzierten, mit Polybren behandelten Zellen etwas zu beachten?
Die AllTaq PCR-Chemie im QIAprep&amp CRISPR Kit ist sehr robust gegenüber Inhibitoren. Die Probenvorbereitung wird nicht beeinträchtigt und die PCR-Reaktion toleriert bis zu 1 µg/ml.
Können die neuen CRISPR PCR-Assays für die digitale PCR (dPCR) auf dem QIAcuity verwendet werden? Gibt es dafür Daten oder ein Protokoll?
Der CRISPR-Q Custom PCR Assay ist nicht zur Verwendung für die dPCR geeignet. Er ist für eine herkömmliche PCR in einem Standard-Thermocycler vorgesehen, und das PCR-Produkt wird auf dem QIAxcel oder einem Gel analysiert. Der CRISPR-Q Custom PCR Assay enthält 2 Primer, welche die Schnittstelle flankieren. Das Ziel sind eine schnelle PCR-Prüfung der Klone sowie die Vorbereitung des Templates für die folgende Sanger-Sequenzierung. Für die Sanger-Sequenzierung werden die entsprechenden CRISPR-Q Sanger-Primer verwendet. Eine dPCR zur Überprüfung des Editierungsereignisses ist eine Alternative zur Sanger-Sequenzierung und wäre spezifisch für das Ereignis.
EpiTect Hi-C
Gibt es im EpiTect Hi-C Workflow Haltepunkte?
Ja. Nach dem Hi-C-Verdau, der Hi-C-Endmarkierung, der Hi-C-Ligation oder dem Chromatin-Decrosslinking im 1. Teil des Hi-C-Workflows können Anwender und Anwenderinnen die Proben bei -15 bis -25 °C lagern und das Verfahren zu einem späteren Zeitpunkt fortsetzen.
Was passiert, wenn Mengen an Ausgangsmaterial eingesetzt werden, die außerhalb des empfohlenen Bereichs liegen?
Bei Verwendung von Einsatzmengen außerhalb des Bereichs zwischen 5 x 103 und 2,5 x 106 menschlichen oder Mauszellen (oder dem Äquivalent von 30 ng–15 µg DNA) je Probe besteht das Risiko einer Beeinträchtigung der Qualität der resultierenden Next Generation Sequencing(NGS)-Bibliothek, mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für ein häufigeres Vorkommen von nach innen gerichteten (FR) Sequenz-Read-Abweichungen, nicht ligierten Enden und Read-Paaren, die benachbarte, neu ligierte Restriktionsfragmente enthalten.
Kann ich Zellen, die zuvor quervernetzt und eingefroren wurden (z. B. für ein ChIP- oder ChIP-Seq-Experiment) als Ausgangsmaterial für das EpiTect Hi-C Protokoll verwenden?
Ja. Allerdings sollten die Zellen mit 1 % Formaldehyd quervernetzt und nicht länger als 6 Monate im eingefrorenen Zustand gelagert worden sein.
Mit welcher Plattform kann ich meine Sequenzierung durchführen?
EpiTect Hi-C Sequenzbibliotheken sind mit allen Illumina-Sequenzierungsplattformen kompatibel.
Kann ich meine eigene Pipeline zur Analyse der Ergebnisse aus EpiTect Hi-C Experimenten verwenden?
Ja. Für Ihre Analyse benötigen Sie die folgenden zusätzlichen Informationen. Die im EpiTect Hi-C Kit eingesetzte Endonuklease schneidet an GATC-Stellen. Die nach der Hi-C-Ligation generierten Hi-C-Motive (oder -Tags) für Verbindungsstellen bestehen aus einer GATCGATC-Sequenz.
Mit welcher Read-Länge sollten die EpiTect Hi-C NGS-Bibliotheken sequenziert werden?
Bei der Sequenzierung von EpiTect Hi-C Bibliotheken auf Illumina Sequenziergeräten können Read-Längen von 36–150 bp verwendet werden. Da die Kartierbarkeit mit der Read-Länge zunimmt, empfehlen wir für bestmögliche Ergebnisse jedoch das Arbeiten mit 2 x 150 bp Sequenzierungs-Reads.
Bietet QIAGEN eine Datenanalyse passend zum EpiTect Hi-C Kit an?
Ja. Besuchen Sie QIAGENs Online GeneGlobe Data Analysis Center unter Hi-C Analysis (qiagen.com), um Ihre Daten mit dem EpiTect Hi-C Data Analysis Portal zu analysieren.
QuantiNova RT-PCR Kit
Benötige ich eine spezielle Ausstattung für die Analyse von Kulturzellen nach der direkten Lyse mit QuantiNova RT-qPCR Kits?
Dieses Verfahren kann mit Standard-Laborausstattung und Real-time PCR-Standard-Thermocyclern durchgeführt werden. Zur Auswahl von geeigneten Assays besuchen Sie QuantiNova LNA Assays über GeneGlobe für den SYBR Green- oder sondenbasierten Nachweis von mRNA.
Wie viele Zellen sind erforderlich, um das Genexpressionsniveau meines editierten Gens oder meiner editierten Gene mittels direkter PCR zu überprüfen?
QuantiNova Einschritt-RT-qPCR Kits können mRNA selbst anhand einer einzelnen Zelle nachweisen. Um eine geeignete Menge an Zellen auszuwählen, sollte jedoch die erwartete Häufigkeit des editierten interessierenden Gens berücksichtigt werden. Empfohlen werden bis zu 2000 Zellen je PCR-Reaktionsgefäß.
Welche Zelllinien eignen sich für die direkte Lyse und RT-qPCR?
Verschiedene Zelllinien wurden erfolgreich im beschriebenen direkten PCR-Protokoll eingesetzt und es ist davon auszugehen, dass alle gängigen Zelllinien sich für dieses Verfahren eignen.
Ist es erforderlich, die Zellen vor der direkten Lyse und RT-qPCR zu waschen?
Ja, sowohl extrazelluläres Material als auch Zelltrümmer und intrazelluläres Material aus toten Zellen, einschließlich RNA oder RNasen und Proteasen, werden in die Zellkultur freigesetzt und können mit der RT-PCR interferieren. Wir empfehlen dringend die Entfernung durch Waschen der Zellen mit Zellkulturmedium.
Muss ich die RT-PCR-Reaktion auf Eis ansetzen?
Nein, die QuantiNova qRT-PCR Kits arbeiten mit einer zweiphasigen Einschritt-qRT-PCR, die sowohl die reverse Transkriptase als auch die Taq-Polymerase bei Umgebungstemperatur inaktiv hält, was eine bequeme Einrichtung bei Raumtemperatur ohne Beeinträchtigung der Leistung möglich macht.