QuantiNova LNA PCR Custom Assays für digitale PCR

• Leistungsstarke Assays, die mit einem praktischen Design-Tool und demselben Algorithmus erstellt werden, der auch für unsere vorgefertigten Assays verwendet wird
• Maßgeschneiderte Assays, die genau auf Ihr Ziel und Ihre Anforderungen zugeschnitten sind, einschließlich des Nachweises neuer Transkripte oder einer bestimmten Isoform oder Spleißvariante
• Möglichkeit, bis zu 10 Sequenzen einzureichen und Assays zur Differenzierung oder zum Nachweis aller Sequenzen zu entwickeln
• Kurze, LNA-verstärkte Primer hoher Spezifität und größerer Flexibilität bei der Assay-Positionierung
• Absolute Quantifizierung von Expressionsänderungen mittels dPCR unter Verwendung des QIAcuity Gerätes und des QIAcuity EG PCR Kit

QuantiNova LNA PCR Custom Assays ermöglichen die genaue und empfindliche Genexpressionsanalyse jedes RNA-Ziels mittels LNA-verstärkter, digitaler PCR auf EvaGreen-Basis. Unser robuster Design-Algorithmus unterstützt die Ensembl-Datenbank für menschliche, Maus- und Ratten-Ziele und vereinfacht die Assay-Erstellung. Kundenspezifische Assays eignen sich gut für Ziele, für die kein vorgefertigter Assay verfügbar ist, zur Unterscheidung von Spleißvarianten und zur Verifizierung neuer mRNA oder lncRNA. Für die digitale PCR haben wir die Assays mit den QIAcuity EG PCR Kits und dem QIAcuity Gerät optimiert und einen einfachen und schnellen absoluten Arbeitsablauf zur Quantifizierung geschaffen, der nur 2 Stunden dauert.

Planen Sie den Einsatz der QuantiNova LNA PCR Custom Assays für die qPCR-Analyse? qPCR-spezifische Produkt- und Leistungsdetails finden Sie auf der entsprechenden qPCR-Katalogseite.

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Optimierte digitale PCR-Analyse mit den QIAcuity EG PCR Kits und dem QIAcuity Gerät

QuantiNova LNA PCR Assays dienen der hochspezifischen Zielamplifikation. Diese kann mittels zweier PCR-Methoden quantifiziert werden: qPCR mit Standard-Echtzeit-Thermocyclern und digitale PCR mit dem QIAcuity Gerät und dem QIAcuity EG PCR Kit (siehe Abbildung Nutzung der QuantiNova LNA PCR Assays bei der digitalen PCR). Nach der cDNA-Synthese mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit ermöglicht die digitale PCR eine hochpräzise Quantifizierung des Zielmoleküls, wobei selbst kleinste Expressionsänderungen bei geringsten Konzentrationen nachgewiesen werden. Eine Reihe von zentralen Assays wurde auf dem QIAcuity Gerät experimentell validiert.

Hochempfindliche und spezifische LNA-verstärkte Assays

QuantiNova LNA PCR Custom Assays werden anhand strenger Designkriterien und laborvalidierter Algorithmen entwickelt, um zuverlässige und genaue Genexpressionsanalyseergebnisse mit höchster Spezifität und Effizienz zu liefern.

Die hohe Bindungsaffinität der LNA-Basen erhöht die Flexibilität der Primerplatzierung auf dem Transkript, sodass durch intelligente Positionierung Assays für ansonsten schwer zu analysierende Ziele entwickelt werden können. Dies ermöglicht eine bessere Zielunterscheidung sowie eine robuste und zuverlässige Quantifizierung, selbst bei AU-reichen Zielen, Transkripten mit geringer Abundanz, Zielen mit hoher Sekundärstruktur und hochkomplexen Proben.

Die hohe Sensitivität der Assays sichert eine hocheffiziente Amplifikation schon ab 1 RNA-Molekül, sodass sich Zielmoleküle mit geringem Vorkommen, wie z. B. lncRNAs, ausgehend von weniger Ausgangsmaterial nachweisen lassen. Die durch die geschickte Platzierung der LNA gesteigerte Spezifität sorgt für ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, das die Erkennung von Sequenzen ermöglicht, die sich nur um ein einziges Nukleotid unterscheiden, und verhindert unspezifische Amplifikation und Primer-Dimer-Bildung.

Erstellt mit einem ausgeklügelten LNA-Design-Algorithmus.

Auf der Basis unserer zwanzigjährigen Erfahrung im LNA-Design waren wir in der Lage, unseren hochentwickelten LNA-Design-Algorithmus zu entwickeln und zu optimieren. Der Assay umfasst mehr als 50 verschiedene Parameter, die alle eingehend anhand strenger Leistungskriterien im Labor validiert wurden, und stellt einen erfolgreichen Zielnachweis sicher. Mit diesem proprietären Algorithmus wurden bereits mehr als 1,3 Millionen Assays entwickelt, und er steht Ihnen für Ihre speziellen Anfragen über unseren praktischen Assay Builder in GeneGlobe zur Verfügung.

Digitale PCR auf EvaGreen-Basis

Für die absolute Quantifizierung mittels dPCR sollten Sie die QuantiNova LNA PCR Assays zusammen mit dem QIAcuity EG PCR Kit verwenden, das die Fluoreszenzdetektion auf EvaGreen-Basis nutzt. EvaGreen ist ein interkalierender Farbstoff, der an Doppelstrang-DNA bindet (ähnlich wie SYBR^® Green) und bei DNA-Bindung fluoresziert. Der Einsatz von EvaGreen-basierter dPCR ist bequem und kostengünstig, da für die Amplifikation und den Nachweis des Produkts nur das Primer-Set benötigt wird. Sie bietet auch eine höhere Auflösung in der dPCR-Reaktion, die in Tausende von Partitionen der dPCR-Nanoplatte unterteilt ist, sodass die für die dPCR-Reaktion benötigte Primerkonzentration nur halb so hoch ist wie bei der qPCR.

Der Custom-Design-Prozess

Mit dem QuantiNova LNA PCR Custom Assay Design Tool können Sie auf einfache Weise hochempfindliche und hochspezifische, LNA-angereicherte PCR-Assays für jede mRNA oder lncRNA entwickeln, für die kein vorgefertigter Assay vorliegt. Mit dem hochmodernen Design-Algorithmus für QuantiNova PCR Assays werden zahlreiche Assay-Kombinationen anhand von mehr als 50 verschiedenen Kriterien bewertet, um innerhalb weniger Minuten den optimalen Assay für Ihr Ziel zu finden. Das Tool wurde für mRNA- und lncRNA-Ziele von Mensch, Maus und Ratte mit einer Länge von mindestens 55 Nukleotiden entwickelt und gleicht die für die jeweilige Spezies relevanten Datenbanken, einschließlich Ensembl und RefSeq, ab. Um das Risiko einer gDNA-Amplifikation zu vermeiden, sind die Assays für bekannte Genziele standardmäßig intronübergreifend ausgelegt, ähnlich wie die vordefinierten Assays.

Einzigartige hochentwickelte Optionen für das Assay-Design

Das Design-Tool für benutzerdefinierte Assays enthält Optionen zur Erstellung transkriptspezifischer Designs für die Unterscheidung von Spleißvarianten, SNPs und Isoformen. Wahlweise lassen sich auch Designs für Assays erstellen, die für alle Transkriptvarianten gelten. Sie können bis zu 10 unterschiedliche Zielsequenzen auf einmal einreichen und entweder zehn verschiedene Assays entwerfen oder für verwandte Transkripte einen für alle gemeinsamen Assay entwerfen.

Referenzgen-Assays können problemlos mit den kundenspezifischen Assays kombiniert werden

Es steht eine große Auswahl an funktionell validierten Referenz-Gen-Assays für Mensch, Maus und Ratte zur Verfügung, die eine hochwertige Datennormierung ermöglichen und zuverlässige Ergebnisse gewährleisten. Diese Assays zielen auf endogene kodierende RNA, lange nicht-kodierende RNA und kleine nukleäre RNA-Moleküle ab, die typischerweise in einer Vielzahl von Geweben konstitutiv exprimiert werden.

Normierung der mRNA/lncRNA qPCR-Ergebnisse

Die Normierung entfernt technische und biologische Abweichungen zwischen den Proben, die nicht mit den untersuchten biologischen Veränderungen zusammenhängen. Eine angemessene Normierung ist entscheidend für die korrekte Auswertung und Interpretation der Ergebnisse. Am häufigsten werden stabil exprimierte Referenzgene zur Normierung verwendet.

Es wird allgemein empfohlen, mehrere endogene Kontroll-Referenzgene zu testen, bevor Sie Ihre eigentliche mRNA/lncRNA-Expressionsanalyse konfigurieren. Diese Kandidaten sollten aus Genen ausgewählt werden, die voraussichtlich über die gesamte Bandbreite der untersuchten Proben hinweg stabil exprimiert werden. Dabei kann es sich um stabil exprimierte mRNA oder lncRNA handeln, die auf der Grundlage der Literatur oder bereits vorhandener Daten (z. B. NGS- oder qPCR-Panel-Screening) ausgewählt wurden. Das QuantiNova LNA PCR-System bietet validierte Referenzgen-Assays für RNA, die in der Regel stabil exprimiert wird und daher ein guter Kandidat für Referenzgene ist.

Alle Referenzgen-Kandidaten sollten für jede Untersuchung empirisch validiert werden. Eine Möglichkeit zur Normalisierung des PCR-Panels bei der Erstellung von Profilen einer großen Anzahl von mRNA/lncRNA ist die Normierung gegen den globalen Mittelwert – den Durchschnitt aller exprimierten mRNA/lncRNA. Bei Proben mit einer hohen Call-Rate (exprimierte Gene) kann dies eine gute Option sein, bei Proben mit niedrigen Call-Raten sollte man jedoch vorsichtig sein. Dies ist auch keine gute Wahl für Proben mit Veränderungen des allgemeinen Genexpressionsniveaus. Weitere Hinweise zur Normierung finden Sie auch im GeneGlobe Data Analysis Center.

Auswertung der digitalen PCR-Daten

Die QIAcuity Software Suite wird zur Auswertung der dPCR-Daten verwendet und umfasst einen Genexpressionstest, der Ihre Ergebnisse als relative Expressionsänderung (Fold Change) und Fold Regulation mit publikationsreifen Abbildungen liefert.

Zweistufige RT-dPCR

Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die reverse Transkriptionsreaktion mit dem QuantiTect Reverse Transcription Kit (Kat.-Nr. 205311, 205313, 205314) durchgeführt wird. Der Einsatz des QuantiNova Reverse Transcription Kit wird nicht empfohlen. Die daraus resultierende cDNA wird dann mittels dPCR unter Verwendung der Master-Mixe des QIAcuity EG PCR Kit zusammen mit einem QuantiNova LNA PCR Assay Ihrer Wahl quantifiziert.

Wichtiger Hinweis: Die in Klammern hinter den Assay-Produktnamen angegebenen Reaktionsmengen sind für die qPCR von Bedeutung. Bei der digitalen PCR wird nur die halbe Primerkonzentration benötigt, allerdings unterscheiden sich die Reaktionsvolumina. Mit der QIAcuity Nanoplate 26K können Sie die gleiche Anzahl von Reaktionen wie angegeben konfigurieren und mit der Nanoplate 8.5K 3,3-mal so viele Reaktionen. Anweisungen zur dPCR finden Sie im Handbuch für den QIAcuity Einsatz.

Versand und Lieferung

QuantiNova LNA PCR Assays werden bei Raumtemperatur geliefert. Vorrätige Assays werden innerhalb von 1–5 Tagen geliefert. Während der Early-Access-Phase muss mit längeren Lieferzeiten gerechnet werden.

Was Sie für den Einstieg in die digitale PCR mit dem QuantiNova LNA PCR-System benötigen

Reverse Transkription: QuantiTect Reverse Transcription Kit (Kat.-Nr. 205311, 205313, 205314)

dPCR Master-Mix: QIAcuity EG PCR Kit

Assays:

QuantiNova LNA PCR Custom Assays eignen sich hervorragend für Anwendungen wie:

• Analyse, Profilierung und Quantifizierung der mRNA- und lncRNA-Expression
• Validierung von RNA-seq-Genexpressionsdaten
• Profilierung der Genexpression
• Signal- und Signalweganalyse
• Bestätigung des Knockdowns der Genexpression durch LNA-GapmeR bzw. siRNA
• Entwicklung von Biomarkern, einschließlich Screening, Identifizierung und Validierung von krankheitsbezogenen Biomarkern
• Überwachung phänotypischer Veränderungen im Zusammenhang mit der Genexpression

Zur Untersuchung einer bestimmten Gruppe von Genen können auch mehrere QuantiNova LNA PCR Assays eingesetzt werden.