Klonierung und DNA-Rekombination

Die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase I von E. coli macht sie für viele Anwendungen ungeeignet. Dem Klenow-Fragment, der großen Domäne, welche die 5'→3'-Polymerase und 3'→5'-Proofreading-Exonuklease enthält, fehlt diese Aktivität. Dadurch eignet es sich für viele nützliche Forschungsapplikationen wie die Synthese doppelsträngiger DNA aus einzelsträngigen Templates, das Auffüllen zurückgesetzter 3'-Enden von DNA-Fragmenten, um 5'-Überhänge stumpf zu machen, den Verdau vorstehender 3'-Überhänge und die Vorbereitung markierter DNA-Sonden. 

So wie die 5'→3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase I von E. coli unerwünscht sein kann, ist bei bestimmten Applikationen auch die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität des Klenow-Fragments unerwünscht. Dieses Problem lässt sich lösen, indem Mutationen eingebracht werden, um ein Klenow-Fragment(3'→5'-Exo)-Enzym zu erhalten, das die 5'→3'-Polymerase-Aktivität aufweist, dem aber die Exonuklease-Aktivität fehlt. Das Klenow-Fragment (3'→5'-Exo-) wird bei einigen Fluoreszenzmarkierungsreaktionen für Mikroarrays und beim Anhängen von dA- und dT-Schwänzen verwendet, einem wichtigen Schritt im Prozess der Ligation von DNA-Adaptern an DNA-Fragmente, welcher häufig bei der Vorbereitung von DNA-Bibliotheken für das Next Generation Sequencing angewandt wird.

Die DNA-Polymerase des T4-Phagen ist ein Mitglied der Polymerase-Familie A, zu welcher auch die DNA-Polymerase I von E. coli, die Taq-DNA-Polymerase und die mitochondriale DNA-Polymerase gehören. Die T4-DNA-Polymerase kann eingesetzt werden, um 5’-Überhänge effektiv mit markierten oder unmarkierten dNTPs zu füllen oder um bei DNA-Molekülen mit 3'-Überhängen stumpfe Enden zu erzeugen. Die T4-DNA-Polymerase ist abhängig vom Template, erfordert einen Primer und hat keine 5’→3’-Exonuklease-Funktion. Die T4-DNA-Polymerase kann unabhängig von der Ligation bei der Klonierung von PCR-Produkten eingesetzt werden. 

Die ligationsunabhängige Klonierung (Ligation Independent Cloning, LIC) ist eine Alternativtechnik zur Klonierung mit Enzym/Ligase. Die Inserts werden durch PCR amplifiziert und die Vektoren entweder durch Restriktionsenzymverdau oder PCR linearisiert. LIC nutzt die 3’→5’-Exonuklease-Aktivität der T4-DNA-Polymerase zur Erstellung von Überhängen mit Komplementarität zwischen Vektor und Insert. Bei der einschrittigen SLIC (sequenz- und ligationsunabhängige Klonierung) werden der linearisierte Vektor und die durch PCR amplifizierten Inserts in einem Röhrchen gemischt und mit T4-DNA-Polymerase behandelt. Die Reaktion wird durch Inkubation der Mischung auf Eis gestoppt und die Lücken und Überhänge werden repariert, nachdem die Mischung in kompetente E. coli-Zellen eingebracht wurde.

Die T4-DNA-Ligase ist die in der Forschung am häufigsten verwendete und vielseitigste Ligase, da das Enzym in der Lage ist, entweder kohäsive oder stumpfe Enden von DNA und Oligonukleotiden zu ligieren. Die T4-DNA-Ligase kann Einzelstrang-Nicks in doppelsträngiger DNA reparieren, ligiert aber keine einzelsträngigen Nukleinsäuren. Die T4-DNA-Ligase verbindet RNA-Moleküle, wenn sie in einem RNA:DNA-Hybrid vorliegen. Die Ligation kohäsiver DNA-Enden mittels T4-DNA-Ligase kann bei 12–16 °C ausgeführt werden, um eine gute Balance zwischen Enzymaktivität und Stabilität der aneinander gelagerten DNA-Überhänge zu erreichen. Die T4-DNA-Ligase kann durch 10-minütige Inkubation bei 65 °C hitzeinaktiviert werden.