dPCR Microbial DNA Detection Assays

• Detecte especies microbianas, genes de virulencia, virus o genes de resistencia a antibióticos
• Ensayos para más de 680 dianas
• La selección de colorantes permite el multiplexado de hasta 5 dianas por reacción
• Flujo de trabajo de dPCR fácil y rápido en el QIAcuity
• Combine dianas de ADN microbiano y ARN vírico en una reacción con el uso del QIAcuity OneStep Advanced Probe Kit

La creación de perfiles y la identificación de perfiles microbianos son de interés para varios campos, como la salud humana, las pruebas de alimentos y piensos y pruebas ambientales. La identificación microbiana determina la presencia o la ausencia de un microbio en una muestra, mientras que la creación de perfiles microbianos determina su expresión relativa en dos o más condiciones experimentales, por lo tanto, necesita una muestra de referencia y un normalizador.

Nuestros dPCR Microbial DNA Detection Assays están orientados a genes bacterianos, fúngicos, parasitarios, víricos, de resistencia a los antibióticos o de factores de virulencia. Para las bacterias, los ensayos se dirigen al gen de ARNr 16S y, para los hongos, a los genes del ARN ribosómico. La gama consta de más de 680 ensayos distintos, 200 de los cuales están probados en laboratorios de química de dPCR (consulte los detalles del ensayo en GeneGlobe).

Cada ensayo consta de un par de cebadores y una sondas de hidrólisis con un colorante fluoróforo configurable. Los fluoróforos configurables son FAM, HEX, ROX, TAMRA y Cy5 y se pueden mezclar y combinar para apoyar el análisis de hasta cinco dianas distintas en una reacción de dPCR múltiple. También ofrecemos paquetes de ensayos 5-plex de dPCR probados en laboratorios de química para el análisis de dianas de interés comunes; consulte las aplicaciones a continuación para obtener más detalles. Para la reacción de dPCR, el ensayo se combina con el QIAcuity Probe PCR Kit (dianas de ADN) o con el QIAcuity OneStep Advanced Probe Kit (dianas de ARN).

El kit funciona junto con el QIAcuity Digital PCR System y las QIAcuity Nanoplates.

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Detección exacta y precisa

Los dPCR Microbial DNA Detection Assays y el QIAcuity dPCR System permiten la cuantificación exacta basada en PCR digital. El análisis del material de referencia del Instituto Nacional de Normas y Tecnología (Institute of Standards and Technology, NIST) mostró la concentración esperada del molde de entrada. Consulte la figura Cuantificación de la norma de referencia 8376 del NIST con el uso del ADNg de Shigella sonnei para obtener más detalles.

Rendimiento en múltiple

La detección de dianas microbianas basada en la dPCR múltiple ofrece una configuración flexible de pequeños paneles en menos reacciones, por lo que conserva muestras valiosas. El multiplexado también aumenta el rendimiento del análisis, ya que necesita menos pocillos de la nanoplaca e incrementa el número de muestras que se pueden analizar en cada serie. Nuestros dPCR Microbial DNA Detection Assays pueden combinarse para los análisis múltiples.

Puede combinar sus propios ensayos para el multiplexado pidiendo ensayos individuales con colorantes distintos (FAM, HEX, TAMRA, ROX o Cy5). O bien, puede elegir entre nuestra oferta de paquetes de ensayos 5-plex, que nuestros científicos ya han probado en laboratorio químico de dPCR. Otras combinaciones de los >685 ensayos deben ser verificadas por su laboratorio.

Una comparación entre los análisis simple y múltiple con el uso de los dPCR Microbial DNA Detection Assays muestra una cuantificación similar y de gran precisión para todas las dianas (consulte la figura Detección microbiana en la dPCR múltiple en QIAcuity). Además de la cuantificación precisa de la diana, una serie de dPCR 5-plex también muestra una detección muy específica de distintos microrganismos patógenos microbianos del agua (consulte la figura Detección de microrganismos patógenos microbianos en 5-plex en QIAcuity).

Los dPCR Microbial DNA Detection Assays está destinados a utilizarse en la PCR digital de nanoplacas. Cada ensayo se basa en una amplificación de PCR de punto final de una región genética específica de la especie del microbio de interés o de una región de un gen microbiano individual. El producto amplificado se detecta con las sondas de hidrólisis fluorescentes específicas de la diana, lo que mejora la especificidad del ensayo.

Los ensayos para la detección de especies bacterianas se dirigen a los genes del ARN ribosómico – sobre todo el gen de ARN ribosómico 16S – y se han diseñado con el uso de la base de datos GreenGenes para secuencias del 16S y las secuencias de ADN de la cepa tipo depositadas en el NCBI. Los ensayos de especies fúngicas, víricas y de metazoos se dirigen a distintas regiones genéticas específicas de la diana, incluidos los genes del ARN ribosómico y otros genes de marcadores individuales, depositados cada uno de ellos en el NCBI. Se utilizaron diversas bases de datos para el diseño de ensayos para los genes de resistencia a antibióticos (p. ej., lahey.org, ARDB, etc.) y genes de factores de virulencia (p. ej., VFDB).

El principio de la reacción de dPCR en las nanoplacas se describe aquí.

El protocolo del dPCR Microbial DNA Detection Assay es sencillo y puede realizarse en cualquier laboratorio con el instrumento QIAcuity dPCR. Se aísla el ADN de la muestra y se añade a la QIAcuity Probe Mastermix lista para usar y al agua sin ADN microbiano (agua UCP). Esta mezcla se alicuota en cada pocillo de la preplaca de dPCR, que contiene juegos de cebadores y sondas de hidrólisis previamente dispensados. Las mezclas de reacción se transfieren desde la preplaca a los pocillos de una nanoplaca para dPCR, que después se sella y transfiere al instrumento QIAcuity dPCR (consulte la figura Flujo de trabajo simple y rápido basado en la placa). El instrumento QIAcuity dPCR realiza las funciones de división en partes, ciclado y obtención de imágenes de forma totalmente automatizada siguiendo los parámetros establecidos previamente. En función del protocolo de ciclado, los resultados de la serie de dPCR se pueden analizar en el QIAcuity Software Suite después de aproximadamente 2 horas (consulte la figura dPCR microbiana en aproximadamente 2 horas con tiempo mínimo de intervención manual).

Los dPCR Microbial DNA Detection Assays están especialmente pensados para la detección de especies bacterianas, fúngicas y víricas y de genes de resistencia a antibióticos microbianos o de factores de virulencia. Se puede analizar una variedad de muestras, incluidas heces, esputo, hisopo vaginal, aguas residuales y otras.

Paquetes de 5-plex probados en laboratorios de química de dPCR

* F: FAM, H: HEX, T: TAMRA, R: ROX o C: Cy5