Todo sobre el ARN: amplificar, secuenciar, ligar y etiquetar
Detectar y manipular el ARN mediante la amplificación
Las transcriptasas inversas son enzimas capaces de polimerizar una hebra de ADN (ADNc) que sea complementaria a un molde original de ARN. El ARN se puede degradar por la acción de las RNases y el uso de una enzima de transcriptasa inversa para producir ADNc resuelve los problemas de trabajar con ARNm. El ADNc se convierte en el molde estable en una variedad de aplicaciones anterógradas para los estudios de ARN, como el análisis de la expresión genética. Se pueden utilizar una PCR normal, una qPCR, una RT qPCR en un solo paso o métodos isotérmicos para amplificar el molde de ADNc. Tras la amplificación, se puede realizar una clonación con protocolos convencionales de enzimas o una clonación independiente de la ligación utilizando la actividad de exonucleasa de 3’→5’ de la ADN polimerasa T4.
Todas las enzimas de transcriptasa inversa (ADN polimerasas dependientes de ARN) se pueden utilizar para:
RNase H (+/−) |
Aplicaciones especializadas | ||
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P7600L EnzScript |
Próximamente | Menos | Para ADNc largos y genotecas con un alto porcentaje de ADNc de longitud completa, aplicaciones que requieren cambio de molde, es decir, secuenciación de ARN |
P7720L StableScript |
Próximamente |
Menos |
Para ADNc largos, procesabilidad mejorada, resistencia a inhibidores y termoestabilidad (temperatura óptima de 55 °C) |
205111 Omniscript Kit |
Más | Marcaje para microarreglos; especialmente diseñados para trascripción reversa con cualquier cantidad de ARN; buffer optimizado; sin necesidad del paso con RNase H. |
ARN polimerasas y ligasas
Las ARN polimerasas o, más concretamente, las ARN polimerasas dirigidas por ADN, son enzimas que sintetizan el ARN a partir de un molde de ADN. La enzima polimerasa poli(A) utiliza ARN monocatenario como primer para añadir una cola de poli(A) al ARN catalizando la incorporación de residuos de adenina en los extremos 3’ de ARN.
Las ARN ligasas T4 son enzimas útiles para los análisis de RNA, en particular previos a procedimientos como la secuenciación de ARN de alto rendimiento y las micromatrices. Las ARN ligasas T4 1 y 2 son enzimas que pueden etiquetar, circularizar o llevar a cabo una ligadura intermolecular de ARN uniendo polinucleótidos adyacentes 3'-OH y 5'-PO4. La unión de los adaptadores a los extremos 3' de ARN con la ARN ligasa T4 1 es un primer paso útil para la cuantificación y el descubrimiento de ARN mediante RT-PCR y secuenciación de alto rendimiento.
Acción | Aplicaciones | ||
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P7180L T7 RNA Polymerase |
Próximamente | Sintetiza ARN en la dirección 5’→ 3’ a partir del molde de ADN; específico para el promotor de T7 |
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P7460L Poly(A) Polymerase |
Próximamente |
Cataliza la adición de AMP de ATP al 3’-OH de ARN para ARN con cola de poli(A) |
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L6050L T4 RNA Ligase 1 |
Próximamente | ARN ligasa monocatenario; también une moléculas de ADN monocatenario |
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L6080L T4 RNA Ligase 2 |
Próximamente | Ligadura de mellas en ARNbc (Ligation of nicks in dsRNA); puede ligar el 3’-OH de ARN al 5’-PO4 de ADN en híbridos bicatenarios |
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L6070L |
Próximamente | Cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un fosfato 5’ sometido previamente a adenilación (ADN o ARN) y el hidroxilo 3’ de ARN |
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Digestión y protección de ARN
El ensayo de protección de ribonucleasas (ribonuclease protection assay, RPA) con la enzima RNase A es un técnica utilizada para determinar la abundancia relativa o absoluta del transcrito y para identificar los extremos del ARNm y los límites entre intrones y exones.
Las sustituciones de una única base se pueden detectar y localizar mediante un sencillo método enzimático que implica la escisión de la RNase A de las discordancias en los heterodúplex de ARN:ADN.
Acción | Aplicaciones | ||
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19101 RNase A |
Endorribonucleasa que degrada el ARNmc en residuos C y U* |
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Y9220L RNase H |
Próximamente | Endorribonucleasa que hidroliza los enlaces fosfodiéster de ARN hibridizado a ADN |
La actividad de la RNase H degrada el molde de ARN de un complejo de ADN:ARN liberando ADNc monocatenario como molde para la síntesis del ADNc de segunda hebra |
Y9240L RNase Inhibitor |
Próximamente | Inhibidor no competitivo de la RNase A, B, C de origen porcino; no inhibe la actividad de la RNase H. | Protege al ARN frente a la degradación; se suele usar como medida de precaución en las manipulaciones enzimáticas del ARN |
Preguntas frecuentes acerca de los análisis de ARN
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