Consejos de aislamiento de ARN

Consejo 1: Tenga en cuenta cuidadosamente la cantidad de muestra inicial.

Para la mayoría de suelos, la cantidad máxima por muestra es de 2 gramos. Pero, para los sedimentos, el mayor contenido en agua implica menos partículas de suelo en una muestra de 2 gramos. Esto puede dar como resultado un rendimiento menor de ARN a partir de las muestras que ya tengan una carga microbiana baja. Por lo tanto, se recomienda un peso húmedo de 5 gramos de muestra para el sedimento.

Nota: Si detecta una cantidad importante de agua encima del suelo después de la recogida, puede centrifugar la muestra brevemente después de añadirla al tubo de esferas para eliminar el exceso de agua.

Consejo 2: Use un PCI apropiado para el suelo

Uso del fenol correcto: Cloroformo: La proporción de alcohol isoamílico (PCI) es importante: consulte las recomendaciones en el manual del kit. El fenol debe estar en una relación de 25:24:1 del PCI y el pH debe estar entre 6.7 y 8, almacenado bajo el tampón TE pH 8.0. Al contrario que las muestras de tejido y células animales, para las que es apropiado un fenol con pH bajo en la preparación del ARN, las muestras de suelo requieren un fenol con pH neutro para conseguir los mejores resultados.

Consejo 3: Optimice la precipitación del isopropanol.

Después de la extracción PCI y la adición de Solution SR3, el siguiente paso es la precipitación del isopropanol para aislar los ácidos nucleicos totales. Si ha empezado con sedimentos, puede que tenga más de 5 ml de muestra después de añadir SR3. Necesitará aumentar la cantidad de SR4 (isopropanol) para igualar el volumen de muestra en el paso 11 del protocolo. Así se garantizará la precipitación completa.

Consejo 4: Adapte la temperatura de precipitación del isopropanol para muestras muy salinas.

El protocolo del kit estándar es congelar las muestras a –20 °C. Pero es mejor precipitar las muestras con salinidad alta a temperatura ambiente, ya que las temperaturas bajo cero hacen que la sal se precipite, cambiando así las condiciones de unión con la columna de intercambio aniónico en la purificación. Sabrá si la muestra ha precipitado sal por la apariencia del sedimento: si es grande y está endurecido, en lugar de plano y brillante como un sedimento de ARN normal, puede que haya sal. Las muestras de sedimento, incluso de lagos de agua dulce, tiene a ser salada por el exceso de agua.

Punto de detención: Para algunos suelos, puede ser posible ampliar la incubación en el paso 12 durante más de 30 minutos o incluso toda la noche sin poner en peligro los resultados. Pero primero, asegúrese de probar esto en sus propias muestras de suelo.

Consejo 5: Asegúrese de que el flujo sea adecuado en la columna.

Las columnas usadas para la purificación final del ARN son de relleno de resina, que usa la gravedad para gotear a lo largo de la columna. A veces, puede que se muevan despacio porque la resina se queda abajo. La aplicación suave de presión positiva puede ayudar a aumentar el flujo de los tampones y la muestra a lo largo de la columna de intercambio aniónico.

Nota: Si existe dificultad persistente con el caudal, puede intentar usar el cuerpo de una jeringa de 5 ml, aplicando una ligera presión a la columna para mejorar el flujo. Para hacerlo, sostenga el extremo del cuerpo de la jeringa firme contra la abertura de la columna. Empuje el émbolo hacia la jeringa, a la vez que mantiene el cuerpo firme contra la columna de forma que el aire no escape alrededor de la parte superior de la columna. Aplique presión con mucha suavidad, sin superar un caudal de 1 gota por segundo.

Consejo 6: Mezcle los componentes de forma adecuada.

A veces, las soluciones que contienen isopropanol pueden separarse mientras están almacenadas. Para garantizar su homogeneidad, agite las soluciones SR5 y SR6 antes del uso. Normalmente, es suficiente con agitar 10 segundos.

Consejo 7: Ahorre tiempo durante la elución.

Si ha usado el kit antes y tiene confianza en el laboratorio, puede considerar ahorrar tiempo eluyendo directamente en un tubo de recogida de 2 ml, en lugar de un tubo de 15 ml. Esto ahorra un paso de transferencia y evita generar desechos de plástico. Si aprovecha este método, la columna de gravedad debe equilibrarse con firmeza sobre el tubo de recogida en una gradilla.

Consejo 8: Asegúrese de que la temperatura sea adecuada para la precipitación final del isopropanol.

Después de la elución desde la columna de flujo por gravedad, la precipitación final se hace de nuevo con el isopropanol (Solution SR4) e incubando a –20 °C. Es importante realizar este paso a –20 °C y no a temperatura ambiente.

Punto de detención: Si no puede finalizarse la preparación en el tiempo disponible, el proceso puede detenerse aquí durante unas horas o toda la noche. Con la muestra congelada a –20 °C, el ARN es estable.

Consejo 9: Controle el sedimento de ARN.

Después de la centrifugación para recoger el ARN del isopropanol, el sedimento normal será pequeño y vítreo. Asegúrese de orientar los tubos en la centrifugadora de la misma forma para poder identificar rápidamente dónde está el sedimento en todos los tubos al decantar el isopropanol.

Nota: Es posible acelerar el secado del sedimento colocando los tubos (invertidos) sobre un tejido sin pelusa en la entrada de aire de la cubierta de cultivo de tejido mientras está encendida.

Consejo 10: Tenga en cuenta la cantidad de agua usada para la resuspensión de ARN.

Una vez que tenga un sedimento seco a mano, resuspenda el ARN en un volumen basado en lo que necesite para la transcripción inversa. Por ejemplo, si el suelo tiene un alto rendimiento de microbios, puede resuspender en 50-100 ul de agua. (Normalmente, la concentración final es de ~100-200 ng/ul). Para sedimentos y suelos secos con baja biomasa microbiana, 25 ul es preferible para que el ARN esté más concentrado para su uso. En este paso, tiene la flexibilidad de decidir la mejor cantidad de agua para la resuspensión del sedimento.