Clonación y recombinación de ADN

La actividad de exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I de E. coli la convierte en no apta para muchas aplicaciones. El Klenow Fragment, el dominio amplio que contiene polimerasa 5'→3' y exonucleasa de corrección de errores de 3'→5', carece de esta actividad, lo que le confiere útiles aplicaciones de investigación, entre las que se incluyen la síntesis de ADN bicatenario a partir de moldes monocatenarios, el complemento de los extremos 3' retraídos de fragmentos de ADN para que los salientes 5' sean romos, la digestión de los salientes 3' que sobresalen y la preparación de sondas de ADN marcadas. 

Del mismo modo que la actividad de exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I de E. coli puede ser indeseable, la actividad de exonucleasa 3'→5' de Klenow Fragment también puede ser indeseable para ciertas aplicaciones. Este problema se resuelve introduciendo mutaciones que den como resultado una enzima Klenow Fragment (3'→5' exo-) que conserva la actividad de polimerasa 5'→3', pero carece de actividad de exonucleasa. Klenow Fragment (3'→5' exo-) se usa en algunas reacciones de marcaje fluorescente para microarreglos y en la adición de bases dA y dT, un paso importante en el proceso de ligación de adaptadores ADN a fragmentos de ADN, frecuentemente usados en la preparación de librerías de ADN para secuenciación de última generación

La ADN polimerasa del bacteriófago T4 es un miembro de la familia de las polimerasas A que incluye DNA polymerasa I de E. coli, ADN polimerasa Taq y ADN polimerasa mitocondrial. T4 DNA polymerase se puede usar eficazmente para complementar salientes 5’ con dNTP etiquetados o no etiquetados o para la generación de extremos romos de moléculas de ADN con salientes 3'. T4 DNA polymerase depende del molde, requiere un primer y carece de una función de exonucleasa 5’→3’. T4 DNA polymerasa se puede usar en la clonación de productos de PCR independientemente de la ligadura. 

La clonación independiente de ligadura (LIC) es una técnica alternativa a la clonación de enzima/ligasa de restricción. Los insertos son amplificados por PCR y los vectores se linealizan, ya sea mediante digestión enzimática de restricción o por PCR. La LIC utiliza la actividad de exonucleasa 3’→5’ de T4 DNA Polymerasa para crear salientes con complementariedad entre el vector y el inserto. En una SLIC (clonación independiente de ligación y secuencia) de un solo paso, el vector linealizado y los insertos amplificados por PCR se mezclan en un solo tubo y se tratan con T4 DNA polymerase. La reacción se detiene al incubar la mezcla en hielo y los espacios y salientes se reparan tras la introducción de la muestra en células de E. coli competentes.

T4 DNA ligase es la ligasa más utilizada y versátil en la investigación de laboratorio porque la enzima puede ligar tanto extremos cohesivos como romos de ADN y oligonucleótidos. T4 DNA ligasa puede reparar muescas monocatenarias en ADN doble pero no liga ácidos nucleicos monocatenarios. T4 DNA ligase une las moléculas de ARN cuando se encuentran en un híbrido de ARN/ADN. La ligadura de extremos de ADN cohesivos con T4 DNA ligasa puede llevarse a cabo a 12–16 °C para garantizar un buen equilibrio entre la actividad enzimática y la estabilidad de unión para los salientes de ADN. T4 ADN ligasa puede ser inactivada incubando a 65° C durante 10 minutos.