Enzymes, NGS, Caucasian female in wheelchair pipetting with a Black male and Asian female in background. Laboratory setting
Enzimas para biología molecular

Limpieza de la reacción y mejora del rendimiento

Estos buenos limpiadores pulen, cortan y recortan

Los reactivos y reactantes que se quedan atrás pueden obstaculizar los procesos posteriores. Utilice la preparación enzimática adecuada para limpiar sus muestras antes de comenzar el siguiente paso. Acelere y mejore la amplificación y la transcripción con algunos aditivos no tan secretos. 

Enzimas para escisión y limpieza de reactivos residuales

La limpieza enzimática  de muestras de ADN con Exonuclease I, DNase I, RNase A y proteasas elimina los cebadores, nucleótidos y enzimas residuales antes del análisis de SNP, la secuenciación de próxima generación, la secuenciación de ADN Sanger u otros análisis anterógrados. 

La enzima TAGZyme DAPase y el sistema TAGZyme se utilizan para la eliminación de la etiqueta His de proteínas que contienen un punto de parada intrínseco DAPase (expresado utilizando el vector TAGZyme pQE-2) o de proteínas que contienen un punto de parada de glutamina diseñado.

Enzima   Actividad Aplicación
X8010L
Exonuclease I		 Próximamente La exonucleasa I escinde el ADN monocatenario en la dirección 3’→5’, liberando los mono/dinucleótidos de 5’ y dejando intactas las moléculas de ADN bicatenario y el extremo 5’; la digestión se inhibe por la presencia de un fosfato de extremo 3’.
  • Eliminación de primers monocatenarios en reacciones de PCR antes del análisis de SNP o la secuenciación Sanger del ADN
  • Eliminación de primers monocatenarios para reacciones de PCR anidadas
  • Eliminación del ADN monocatenario lineal, dejando ADN bicatenario en la muestra
79254
RNase-free DNase
(1500 unidades Kunitz)
Endonucleasa que corta inespecíficamente el ADN para liberar
productos di-, tri- y oligonucleótidos con 5’ extremos fosforilados
y 3’ hidroxilados; actúa sobre ADNmc y ADNbc,
cromatina e híbridos ARN:ADN
  • Eliminación del ADN contaminante de las soluciones de ARN antes
    de la limpieza y concentración del ARN
  • Extracción de ADN de muestras de proteínas
  • Fragmentación del ADN como primer paso para incorporar bases etiquetadas
    al ADN
  • Análisis de la interacción ADN-proteína (ensayo de huellas)
19101
RNase A
Endorribonucleasa que degrada el ARNmc en residuos C y U
  • Eliminación del ARN contaminante de las preparaciones de plásmidos
    y ADN genómico
  • Eliminación del ARN de las preparaciones de proteínas recombinantes
  • Identificación de mutaciones de una única base en el ADN o el ARN
    (ensayo de protección de la RNase)
19131
Proteinase K
QIAGEN Proteinase K es una proteasa de tipo subtilisina aislada
del hongo saprofito Tritirachium album
  • Digestión con proteasas en los procedimientos de aislamiento de ADN y ARN
  • Proteinase K posee una elevada actividad específica; es estable en
    una amplia gama de temperaturas y valores de pH; no la inhibe
    el EDTA; es adecuada para tiempos de digestión cortos
19155
Protease
QIAGEN Protease es una proteasa de serina aislada de
una cepa recombinante de Bacillus; una alternativa económica
a Proteinase K		 Digestión con proteasas en el aislamiento de ADN y ARN nativos de
diversas fuentes
34362
TAGzyme DAPase
Enyzme
TAGZyme DAPase (dipeptidil peptidasa I recombinante)
  • Eliminación secuencial de dipéptidos a partir de etiquetas His
    N-terminales hasta el "punto de parada" expresado mediante vectores TAGZyme pQE
  • Producción de proteínas sin la etiqueta His para:
    • Determinación de la estructura de las proteínas
    • Proteínas terapéuticas

Mejora de los rendimientos

El uso de proteínas de unión al ADN en las reacciones de amplificación y secuenciación puede mejorar el rendimiento y la calidad de esas moldes. La proteína de unión al ADN, proteína del gen 32 del bacteriófago T4 (T4gp32), aumenta la eficacia de la amplificación por PCR con una serie de moldes diversos. Además, el uso de la proteína de unión al ADN monocatenario (single-stranded DNA-binding, SSB) de E. coli en las reacciones de secuenciación del ADN aumenta la resolución de las series de secuenciación.

El tratamiento con pirofosfatasa inorgánica, componente esencial de las reacciones de preparación del ARN, permite aumentar la tasa de transcripción in vitro. Esta enzima escinde el pirofosfato en dos moléculas de fosfato e impide que el pirofosfato precipite con el magnesio.

Reactivo   Actividad Aplicación
Y9030L
E. coli ssDNA Binding
Protein		 Próximamente Se une con gran especificidad al ADN monocatenario; termoestable
  • Útil en el secuestro de primers
  • Útil para aumentar la especificidad de la PCR
  • Útil para permitir la secuenciación de moldes de ADN problemáticos
Y9130L
T4 Gene 32 Protein		 Próximamente
 Estabiliza las regiones de ADN de cadena sencilla

Aumenta la procesividad de algunas ADN polimerasas
Y9380L
E. coli pyrophosphatase		 Próximamente
Pirofosfatasa inorgánica que cataliza la hidrólisis del pirofosfato inorgánico para formar ortofosfato*.
  • Aumenta el rendimiento del ARN en la reacción de transcripción
  • Mejora de la replicación del ADN
Y9370L
Thermostable
pyrophosphatase		 Próximamente
 La pirofosfatasa termoestable es una enzima recombinante de Sulfolobus acidocaldarius que cataliza la hidrólisis del pirofosfato inorgánico para producir ortofosfato†

Útil para potenciar la replicación del ADN en la PCR

Escisión de hebras mediada por UDG

La escisión de hebras mediada por UDG (Uracil ADN glicosilasa en inglés) es una herramienta importante en biotecnología molecular, que permite la escisión controlada y de localización específica de ADN monocatenario o bicatenario sintetizado química o enzimáticamente con incorporaciones únicas o múltiples de desoxiuridina. 

Eliminar los artefactos antes del NGS
Eliminar los artefactos antes del NGS
El tratamiento con UDG elimina los artefactos de uracilo (citosina desaminada) de los tejidos tumorales FFPE y reduce los artefactos en el ADN antiguo antes de la secuenciación de próxima generación. 
Eliminar la contaminación por "arrastre" de PCR
Eliminar la contaminación por "arrastre" de PCR
La UDG termolábil elimina el “arrastre” de PCR cuando los productos de PCR se vuelven susceptibles a la degradación mediante la sustitución de dTTP por dUTP en la reacción primaria.
Generar huecos en los residuos de uracilo
Generar huecos en los residuos de uracilo
La mezcla de enzimas 10x Uracil Cleavage System puede generar brechas de un solo nucleótido en la ubicación específica de los residuos de desoxiuridina.
Los tratamientos con UDG pueden reducir los artefactos de secuencia, eliminar el arrastre de PCR y generar huecos específicos en el ADN.
 Enzima   Actividad Aplicación

19160, G5010L
Uracil DNA
Glycosylase (UDG)

G5020L
Thermolabile UDG

 Próximamente
 La glicosilasa de ADN de uracilo (UDG) interviene en la reparación por escisión de bases; la UDG crea puntos abásicos en el ADN que contiene uracilo; degrada el ADN que contiene uracilo.

  • El pretratamiento del ADN con UDG reduce los artefactos del ADN durante la detección de mutaciones por secuenciación de nueva generación y otros métodos, sin afectar a la capacidad de detectar mutaciones reales.

  • Elimina los artefactos de uracilo (citosina desaminada) de las preparaciones FFPE.

  • La UDG termolábil puede utilizarse para eliminar la contaminación por “arrastre” de la PCR cuando se sustituye el dTTP por el dUTP en la mezcla de reacción de la PCR primaria.

Y9180L
10X Uracil Cleavage
System		 Próximamente
 El sistema consta de dos componentes enzimáticos, Uracil DNA Glycosylase y Endonuclease VIII. Cuando las enzimas se añaden secuencialmente a una reacción en la que un fragmento de ADN sintético contiene un desoxiuracilo, se genera un hueco de un solo nucleótido en la ubicación del residuo de uracilo
  • Genera enzimáticamente huecos de nucleótidos de uracilo in vitro
  • La UDG es una enzima específica del ADN que no elimina el uracilo de sustratos de ARN. La incorporación dirigida de nucleótidos de desoxiuridina en oligonucleótidos puede utilizarse con el sistema enzimático para la escisión específica de secciones de ADN o moldes de ADN, a partir de híbridos ADN:ARN.
Y9080L
Endonuclease VIII		 Próximamente
 Endonuclease VIII funciona a la vez como N-glicosilasa (eliminando las lesiones oxidativas de la base) y como AP-liasa (eliminando posteriormente el grupo fosfodiéster), dejando fosfatos terminales en los extremos 5’ y 3’; participa en la reparación por escisión de bases de los daños oxidativos del ADN 
  • Elimina las pirimidinas dañadas del ADN doble
  • Se utiliza para medir el daño en el ADN mediante electroforesis en gel unicelular (ensayo cometa)
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Preguntas frecuentes sobre la reducción de artefactos y la limpieza de reacciones

¿Cómo crea lagunas en el ADN el tratamiento con UDG y endonucleasas?

Uracil DNA Glycosylase reconoce una base de uracilo y luego elimina el uracilo del ADN escindiendo el enlace N-glicosídico; esto resulta en la formación de un punto abásico (punto AP). In vivo, la UDG permanece unida al punto AP hasta que la sustituyen endonucleasas específicas con una afinidad mucho mayor por los puntos abásicos. Tales enzimas, como Endonuclease VIII o Endonuclease III, tienen una actividad de AP-liasa que cataliza la escisión del esqueleto fosfodiéster 3’ y/o 5’ del sitio AP, liberando la desoxirribosa libre de bases, y formando así un hueco de un solo nucleótido.

¿De qué manera la proteína de unión al ADN monocatenario de E. coli mejora el rendimiento del ADN?

La proteína de unión al ADN monocatenario (single-stranded DNA binding, SSB) se une preferentemente al ADN monocatenario, formando un tetrámero de cuatro subunidades idénticas de 18,9 kDa que protege de 8 a 16 nucleótidos, mientras que no se une bien al ADN bicatenario. En la naturaleza, la SSB participa en la replicación del ADN, así como en funciones de recombinación y reparación. In vitro, se ha descubierto que la SB estimula ciertas reacciones mediadas por la ADN polimerasa al relajar la estructura secundaria del ADN y mejorar la procesividad de la enzima.
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