Enzimas para analizar ARN | Transcriptasas inversas y ARN ligasas

Todo sobre el ARN: amplificar, secuenciar, ligar y etiquetar

Existe un conjunto de enzimas que permiten manipular el ARN para el análisis anterógrado de la expresión genética. Las transcriptasas inversas generan ADN complementario (ADNc) de un transcrito. El ADNc se puede etiquetar o amplificar para clonación o estudios cuantitativos. Las ARN ligasas unen bases, etiquetas y adaptadores, las polimerasas añaden ribonucleótidos de ARN y las ribonucleasas los eliminan.

Detectar y manipular el ARN mediante la amplificación

Las transcriptasas inversas son enzimas capaces de polimerizar una hebra de ADN (ADNc) que sea complementaria a un molde original de ARN. El ARN se puede degradar por la acción de las RNases y el uso de una enzima de transcriptasa inversa para producir ADNc resuelve los problemas de trabajar con ARNm. El ADNc se convierte en el molde estable en una variedad de aplicaciones anterógradas para los estudios de ARN, como el análisis de la expresión genética. Se pueden utilizar una PCR normal, una qPCR, una RT qPCR en un solo paso o métodos isotérmicos para amplificar el molde de ADNc. Tras la amplificación, se puede realizar una clonación con protocolos convencionales de enzimas o una clonación independiente de la ligación utilizando la actividad de exonucleasa de 3’→5’ de la ADN polimerasa T4.

Todas las enzimas de transcriptasa inversa (ADN polimerasas dependientes de ARN) se pueden utilizar para:

Sintetizar ADNc

Síntesis de ADNc de primera hebra
Síntesis de ADNc bicatenario para clonación

La RT de ARNm cebado con oligo(dT) genera un ADNc de primera hebra con un bucle en el extremo 3'. La eliminación de ARNm deja moléculas de ADNc monocatenario con el bucle 3' las cuales puede utilizar la transcriptasa inversa como cebador para la síntesis de la segunda hebra de ADNc.

Amplificar el ADNc

Transcripción inversa (reverse transcription, RT) y RT-PCR
Real-time RT-PCR cuantitativa

En la RT, el ARNm aislado se convierte a ADNc con transcriptasa inversa y cebadores específicos, oligómeros aleatorios u oligo(dT). La RT-PCR empieza con la RT y utiliza el ADNc para la amplificación por PCR. La RT-qPCR combina la amplificación por PCR con la detección y la cuantificación en un único ensayo.

Analizar el ARNm

Extensión del cebador
Etiquetado del ADNc

En la extensión del cebador, se determina el lugar de inicio de la transcripción genética mediante la identificación del extremo 5' del ARNm codificado a través del análisis de un producto de ADNc intermedio. Los protocolos de etiquetado directo de ADNc utilizan dNTP modificados que se incorporan durante la reacción de la RT.

		RNase H (+/−)	Aplicaciones especializadas
P7600L EnzScript	Próximamente	Menos	Para ADNc largos y genotecas con un alto porcentaje de ADNc de longitud completa, aplicaciones que requieren cambio de molde, es decir, secuenciación de ARN
P7720L StableScript	Próximamente	Menos	Para ADNc largos, procesabilidad mejorada, resistencia a inhibidores y termoestabilidad (temperatura óptima de 55 °C)
205111 Omniscript Kit		Más	Marcaje para microarreglos; especialmente diseñados para trascripción reversa con cualquier cantidad de ARN; buffer optimizado; sin necesidad del paso con RNase H.

ARN polimerasas y ligasas

Las ARN polimerasas o, más concretamente, las ARN polimerasas dirigidas por ADN, son enzimas que sintetizan el ARN a partir de un molde de ADN. La enzima polimerasa poli(A) utiliza ARN monocatenario como primer para añadir una cola de poli(A) al ARN catalizando la incorporación de residuos de adenina en los extremos 3’ de ARN.

Las ARN ligasas T4 son enzimas útiles para los análisis de RNA, en particular previos a procedimientos como la secuenciación de ARN de alto rendimiento y las micromatrices. Las ARN ligasas T4 1 y 2 son enzimas que pueden etiquetar, circularizar o llevar a cabo una ligadura intermolecular de ARN uniendo polinucleótidos adyacentes 3'-OH y 5'-PO4. La unión de los adaptadores a los extremos 3' de ARN con la ARN ligasa T4 1 es un primer paso útil para la cuantificación y el descubrimiento de ARN mediante RT-PCR y secuenciación de alto rendimiento.

		Acción	Aplicaciones
P7180L T7 RNA Polymerase	Próximamente	Sintetiza ARN en la dirección 5’→ 3’ a partir del molde de ADN; específico para el promotor de T7	Síntesis de ARNm in vitro Etiquetado de sondas de ARN Generación de ARN para estudios de ARN Control de expresión mediante ARN antisentido Síntesis de ARN guía (sgRNA)
P7460L Poly(A) Polymerase	Próximamente	Cataliza la adición de AMP de ATP al 3’-OH de ARN para ARN con cola de poli(A)	Etiquetado de 3' de ARN con ATP o cordicepina Addición de cola de poli(A) a ARN La cola de poli(A) mejora la traducción del ARN transferido a células eucariotas
L6050L T4 RNA Ligase 1	Próximamente	ARN ligasa monocatenario; también une moléculas de ADN monocatenario	Ligadura de ARN o ADN monocatenario Etiquetado del extremo 3' de ARN o ADN monocatenario
L6080L T4 RNA Ligase 2	Próximamente	Ligadura de mellas en ARNbc (Ligation of nicks in dsRNA); puede ligar el 3’-OH de ARN al 5’-PO4 de ADN en híbridos bicatenarios	Unión con molde de varios oligonucleótidos Síntesis de ARN que contienen modificaciones o etiquetas específicas de un lugar Ligadura de mellas del ARNbc (nick ligation of dsRNA) Ligadura de 3’-OH de ARN a 5’-PO₄ de ADN en un ADN/ARN doble
L6070L T4 RNA Ligase 2 (truncada)	Próximamente	Cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un fosfato 5’ sometido previamente a adenilación (ADN o ARN) y el hidroxilo 3’ de ARN	Ligaduras de conector con 5’ de ADN sometido previamente a adenilación a hidroxilo 3’ de ARN Clonación y secuenciación de ARN pequeños

Digestión y protección de ARN

El ensayo de protección de ribonucleasas (ribonuclease protection assay, RPA) con la enzima RNase A es un técnica utilizada para determinar la abundancia relativa o absoluta del transcrito y para identificar los extremos del ARNm y los límites entre intrones y exones.

Las sustituciones de una única base se pueden detectar y localizar mediante un sencillo método enzimático que implica la escisión de la RNase A de las discordancias en los heterodúplex de ARN:ADN.

		Acción	Aplicaciones
19101 RNase A		Endorribonucleasa que degrada el ARNmc en residuos C y U*	Determinación de abundancia relativa o absoluta de los transcritos Identificación de los extremos de ARN y los límites entre intrones y exones (RPA) Identificación de mutaciones de una única base en ADN o ARN Extracción de ARN de preparaciones de plásmidos y ADN genómico Extracción de ARN de preparaciones proteínicas recombinantes
Y9220L RNase H	Próximamente	Endorribonucleasa que hidroliza los enlaces fosfodiéster de ARN hibridizado a ADN	La actividad de la RNase H degrada el molde de ARN de un complejo de ADN:ARN liberando ADNc monocatenario como molde para la síntesis del ADNc de segunda hebra
Y9240L RNase Inhibitor	Próximamente	Inhibidor no competitivo de la RNase A, B, C de origen porcino; no inhibe la actividad de la RNase H.	Protege al ARN frente a la degradación; se suele usar como medida de precaución en las manipulaciones enzimáticas del ARN

¿Busca más enzimas?

Suscríbase ahora y sea el primero en recibir notificaciones de nuestro catálogo completo, próximamente

Preguntas frecuentes acerca de los análisis de ARN

La transcriptasa inversa (reverse transcriptase, RT), también conocida como ADN polimerasa dependiente de ARN, es una enzima de ADN polimerasa que transcribe ARN monocatenario en ADN. La RT retroviral tiene tres actividades bioquímicas secuenciales: Actividad ADN polimerasa dependiente de ARN, ribonucleasa H (RNase H) y actividad ADN polimerasa dependiente de ADN. En conjunto, estas tres actividades permiten a la enzima convertir el ARN monocatenario en ADNc bicatenario. Los virus como el VIH y el de la hepatitis B utilizan las transcriptasas inversas para replicar sus genomas. Las transcriptasas inversas también las utilizan los elementos genéticos móviles para proliferan dentro del genoma anfitrión y las células eucariotas para extender los telómeros en los extremos de sus cromosomas lineales.

Las transcriptasas inversas se utilizan en biología molecular para detectar y manipular moléculas de ARN mediante un proceso de amplificación. El punto de partida de la nueva síntesis es un oligonucleótido corto de ADN llamado cebador que se une al molde de ARN. La transcriptasa inversa polimeriza una hebra de ADN complementaria al molde de ARN original, denominada ADNc. A continuación, el ADNc puede amplificarse mediante PCR, PCR cuantitativa o métodos isotérmicos.

La ARN polimerasa abre localmente el ADN bicatenario para que se pueda utilizar una hebra de los nucleótidos expuestos como molde para la síntesis de ARN; este es el proceso de transcripción. En la replicación del ADN, una ADN helicasa separa las dos hebras de la doble hélice del ADN para formar una estructura denominada horquilla de replicación y dejar al descubierto dos hebras simples. A continuación, las ADN polimerasas replicantes utilizan cada hebra como molde para construir una nueva hebra de ADN idéntica. En la transcripción del ADN, la ARN polimerasa actúa para desenrollar el ADN y sintetizar el pre-ARNm.

La primasa es una ARN polimerasa dependiente del ADN que desempeña una función esencial en la replicación del ADN. Tras el desenrollamiento del ADN progenitor por la helicasa en un lugar de origen, la primasa ensambla en cada hebra de molde el cebador de ARN corto que la ADN polimerasa replicativa extiende con desoxinucleótidos. La ARN polimerasa II, la enzima que sintetiza el ARNm a partir del ADN en las células eucariotas, no necesita un cebador para iniciar la síntesis. La necesidad de un cebador varía entre las ARN polimerasas dependientes del ARN viral. Las transcriptasas inversas requieren un cebador de ARNt.

Las células eucariotas contienen tres ARN polimerasas que transcriben diferentes clases de genes. La ARN polimerasa II trascriben los genes que codifican proteínas; las ARN polimerasas I y III transcriben los ARN ribosómicos (ARNr) y los ARN de transferencia (ARNt). La transcripción del genoma mitocondrial la realiza una ARN polimerasa que está relacionada de manera lejana con la ARN polimerasa del bacteriófago T7

La poli(A) polimerasa, o polinucleótido adenilil-transferasa, cataliza la incorporación de residuos de adenina en los extremos 3’ del ARN utilizando ARN monocatenario como primer y añadiendo de manera efectiva una cola poli(A) al ARN. La poli(A) polimerasa es una polimerasa independiente del molde que pertenece a la gran superfamilia de nucleotidil transferasas de la familia X, que también incluye la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT).

¿Tiene alguna pregunta?

¿Necesita información más detallada sobre nuestras enzimas?
¿Está a punto de iniciar un nuevo laboratorio? Su representante de ventas más cercano espera tener noticias suyas.

Póngase en contacto con nosotros

Análisis de ARN