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Protocolo de PCR digital — descripción general
El desarrollo de un ensayo de PCR digital (dPCR) depende de varios factores, entre los que se incluyen el molde, el instrumento utilizado, las aplicaciones y los objetivos del experimento. La mayoría de los protocolos de PCR incluyen una variación de estos pasos:
Preparación de las muestras — ensayo de dPCR
Pureza de la muestra
Dado que la PCR depende de varias series de reacciones enzimáticas, es más sensible a las impurezas, como las proteínas, el fenol/cloroformo, las sales y el EDTA que las reacciones catalizadas por enzimas de un solo paso. La pureza de los ácidos nucleicos es importante para la dPCR, ya que los contaminantes pueden interferir con la detección de fluorescencia.
- Los alcoholes (etanol, isopropopanol) y las sales dañan las propiedades de hibridación de los primers y las sondas así mismo, reducen la eficiencia de la amplificación, p. ej., reducción de la fluorescencia de positivos e impedimento en la discriminación de particiones positivas y negativas
- Los ácidos húmicos suprimen la fluorescencia de los colorantes de unión al ADNbc, p. ej., EvaGreen
- Las nucleasas degradan el ARN y el ADN
- La urea y el fenol desnaturalizan la taq polimerasa
- Los polisacáridos ácidos imitan los ácidos nucleicos y forman complejos de punto muerto con la taq polimerasa
A pesar de ser menos propensa a los efectos inhibitorios que la qPCR, la dPCR funciona de forma óptima con moldes de alta pureza. Existen varios kits para obtener un ácido nucleico de alta pureza y eficiencia en la PCR en función del molde, como el ADN genómico, el ADN plásmido, el ARN total, etc.
Integridad de la muestra: Longitud y secuencia
La longitud y la secuencia de los amplicones tienen tanta influencia como la pureza del molde en determinar el éxito de un experimento de dPCR. El ARN y el ADN de molde altamente degradados tienden a presentar una discrepancia entre la cantidad de ADN cuantificado por DO y el número de copias amplificadas y detectadas mediante dPCR. Se podría necesitar una cantidad de ADN mayor que la esperada para alcanzar la sensibilidad deseada (p. ej., en la detección de mutaciones). Se recomienda mantener los amplicones tan cortos como sea posible, particularmente al utilizar muestras muy degradadas (ADN de FFPE, ADN libre circulante).De forma similar, la reticulación residual puede impedir la separación y la amplificación de las hebras y los sitios abásicos pueden inducir una amplificación inespecífica. Se dispone de kits y protocolos dedicados para la recuperación de ADNg de alta calidad de muestras de FFPE.
Se recomienda usar la digestión de restricción antes del ensayo de PCR digital en cualquiera de estos casos:
- Soluciones altamente viscosas : la alta viscosidad podría disminuir la exactitud de la medición, especialmente al usar cantidades más grandes de ADN en volúmenes más pequeños. Al utilizar digestión de restricción para reducir la viscosidad, se podrían usar concentraciones de ADN mucho más altas (1 µg) en el protocolo de dPCR.
- Copias de genes ligadas o en tándem : si una división positiva contiene varias copias, las copias ligadas se contarían como una sola copia. Este problema se puede solucionar mediante el uso de digestión de restricción para separar físicamente las copias de genes a fin de segregarlas de forma independiente en las particiones.
- Plásmidos superenrollados : se recomienda la digestión de restricción para linealizar el ADN plásmido y mejorar la accesibilidad y la eficiencia de la unión del primer o la sonda al ADN. Esto mejora la exactitud de la cuantificación del plásmido.
- Moléculas grandes de ADN (>30 kb) : las moléculas más grandes de ADN podrían particionarse de manera irregular, lo que daría lugar a una sobrecuantificación de la concentración de moldes. La digestión de restricción ayuda a fragmentar los moldes grandes en tamaños más pequeños, lo que da como resultado una distribución uniforme y una cuantificación más exacta.
Una nota a tener en cuenta
Al seleccionar enzimas de restricción, la enzima no debe cortar dentro de la propia secuencia del amplicón.
Cantidad de entrada de la muestra
La cantidad de entrada de las muestras depende de la tecnología de dPCR utilizada. En la PCR digital QIAcuity basada en nanoplacas, se pueden usar hasta 217.000 copias por reacción en 26k nanoplates y hasta 170.000 copias en 8.5k nanoplates.Cómo calcular el número de copias
Si se conoce el tamaño del genoma haploide de un microrganismo, la correlación entre la entrada de masa de ADN genómico (ADNg) y el número de copias resultante (para un gen de una sola copia) se puede calcular con la siguiente fórmula:
Tamaño del genoma (pares de bases) × peso medio de un par de bases único (1,096 × 10–21 g/bp).
Por ejemplo, para el genoma humano con un tamaño de genoma de aproximadamente 3,3 × 109 bp, el cálculo es el siguiente:
3,3 × 109 bp × 1,096 × 10−21 g/bp = 3,3 × 10−12 g = 3,3 pg
La tabla siguiente muestra el número de copias de 10 ng de ADNg de varios microrganismos como modelos.
Una nota a tener en cuenta
En dPCR, el número medio de copias/particiones no debe ser superior a 5. Lo ideal es que se encuentre en el intervalo de 0,5 a 3.
Réplicas
Se recomienda analizar las muestras por duplicado o triplicado para evitar sesgos en la cuantificación a causa de errores de pipeteo. Al añadir los datos de los duplicados juntos, aumenta el número de eventos medidos. Esto permite aumentar la precisión del ensayo de PCR digital.
Controles
- Controles negativos:– son necesarios para supervisar las reacciones falsas positivas, que podrían surgir por la contaminación o los problemas con los primers y las sondas. Los controles negativos también se usan para determinar el límite de detección (LOD).
- Controles positivos:– se usan para comprobar si la amplificación de temperatura ocurre en las condiciones de reacción establecidas
- Controles sin molde (NTC):– Control de la contaminación en todos los reactivos
PCR digital en el sistema QIAcuity: Una introducción
En este seminario web se tratan varios aspectos fundamentales de la PCR digital en los instrumentos de QIAcuity, haciendo hincapié en la elección de moldes y sus concentraciones.
Química de detección
Cómo diseñar primers y sondas
Una diferencia entre el diseño de primers y sondas para un protocolo de PCR digital es que las concentraciones de los primers y las sondas en la dPCR tienden a ser más elevadas que las de la qPCR. Las concentraciones de primer y sonda más elevadas aumentan la intensidad/amplitud de la fluorescencia, lo que permite separar mejor el ruido de fondo de señales específicas. En última instancia, se puede lograr una cuantificación de elementos diana más exacta. Las pruebas sugieren que se obtienen resultados óptimos en la concentración final del primer establecida entre 0,5 µM – 0,9 µM y en el caso de las sondas a 0,25 µM por reacción.
Almacenamiento de primers y sondas
Además del cuidadoso diseño del ensayo y del uso de concentraciones de los primers y sonda adecuadas, también es fundamental el correcto almacenamiento de los primers y las sondas para que la dPCR sea exitosa.
Los primers y sondas liofilizados deben disolverse en un pequeño volumen de tampones hiposódicos, como el tampón TE a 100 µM (10 mM de Tris·Cl, 1 mM de EDTA, pH 8.0) para ofrecer una disolución madre de concentración. Como excepción, las sondas marcadas con colorantes fluorescentes Cy5 y Cy5.5 deben almacenarse en tampón TE pH 7.0 porque tienden a degradarse en un pH más elevado.
Para almacenar los primers, se pueden usar alícuotas pequeñas en tampón TE libre de nucleasas a −20 °C durante un año como mínimo. Las sondas marcadas con fluorescencia son estables en las mismas condiciones durante 6 a 9 meses. Deben evitarse los ciclos de congelación-descongelación repetidos para reducir el riesgo de degradación.
En el caso de los conjuntos de primer y sonda que se utilizan en los ensayos de dPCR múltiples, se podrían utilizar mezclas de primer-sonda 20x, con 2 primers y 1 una sonda para un elemento diana en particular en las concentraciones sugeridas.
Para reconstituir los primers y las sondas, se debe centrifugar suavemente un tubo que contiene la sonda o primer liofilizado para llevar todo el material en el fondo del tubo. El volumen necesario de tampón TE libre de nucleasas estéril debería añadirse, mezclarse y dejarse durante 20 minutos para permitir que el primer o la sonda se disuelvan por completo. La solución del primer o la sonda deben mezclarse nuevamente y la concentración debe determinarse por espectrometría. Un consejo para la resolución de problemas de dPCR es evitar disolver los primers y las sondas en agua. Algunos de estos primers y sondas tienen una solubilidad y una estabilidad más bajas en agua que en el tampón TE.
Realizar un ensayo de dPCR
Consejos para cargar muestras
El primero de los tres pasos de la reacción de dPCR es la preparación y carga de la muestra. Durante la preparación de la mezcla de PCR y la carga de la nanoplaca, se pueden tener en cuenta las siguientes recomendaciones:
- Descontamine el espacio de trabajo y el equipo de laboratorio para reducir el riesgo de contaminación de ADN extraño
- Para garantizar la máxima eficiencia de la PCR, pruebe la muestra en diferentes diluciones antes del ensayo de PCR digital principal.
- Descongele por completo todos los componentes antes de preparar las mezclas de reacción y mezcle bien los componentes para obtener soluciones homogéneas y centrifugue brevemente para evitar derrames.
- Combine la mezcla maestra con la muestra, los primers, el agua libre de RNasas y las enzimas de restricción, si se utiliza alguna
- Use puntas de pipeta estériles
- Pipetee la mezcla de la reacción en la nanoplaca. Asegúrese de no introducir burbujas en los pocillos de la nanoplaca de dPCR durante la transferencia de la muestra y el transporte posterior de la placa
- Para evitar la evaporación y la contaminación, use un rodillo para sellar cuidadosamente la nanoplaca con una película.
- Transfiera la nanoplaca al instrumento de dPCR únicamente sujetando los bordes laterales de la placa, evitando agitarla o girarla para asegurarse de que la mezcla de la reacción de dPCR permanezca en el fondo de los pocillos
- Configure el software e inicie la ejecución de ensayo de dPCR
Consejos para la amplificación
El segundo de los tres pasos de reacción de dPCR es la ejecución de un protocolo de dPCR mediante amplificación. Durante este paso, la mezcla de reacción de cada pozo se separa en miles de reacciones individuales. La reacción de PCR se lleva a cabo en un termociclador. Si hay material del molde presente dentro de una partición, se detecta una señal de fluorescencia positiva durante la adquisición de imágenes. Las imágenes se procesan con software dedicado. Generalmente, el estado de la placa actual se puede supervisar en el mismo instrumento de dPCR o utilizando el paquete de software conectado.
Los consejos para lograr condiciones de amplificación óptimas y eficiencia en la PCR incluyen:
- Temperatura de hibridación: puede influir en la especificidad del ensayo de dPCR, que suele establecerse a una temperatura de entre 55 °C y 65 °C, la temperatura de hibridación óptima se obtiene cuando se alcanza la separación máxima entre las particiones positivas y negativas; el aumento de la temperatura de hibridación podría ser beneficioso para mejorar la separación entre las señales positivas y el ruido de fondo
- Ciclos de amplificación: se recomienda ejecutar 40 ciclos de amplificación para obtener la separación suficiente entre las señales positivas y el ruido de fondo. En algunos casos, es posible que sea necesario aumentar el número de ciclos térmicos para lograr un rendimiento óptimo
Análisis de datos de PCR digital
En el último de los tres pasos de reacción de dPCR, se realiza el análisis de datos de PCR digital con cuantificación absoluta basada en las estadísticas de Poisson.
El QIAcuity Software Suite puede realizar un análisis de datos de PCR digital de acuerdo con los objetivos de aplicación: cuantificación absoluta, detección de mutaciones, edición de genomas, variación en el número de copias o expresión génica. En el análisis de cuantificación absoluta (análisis de primer nivel) el software genera un diagrama de concentración, así como una vista de particiones positivas y negativas de los pocillos seleccionados. La vista de mapa de calor muestra el canal del gen diana y el de referencia. Se pueden usar histogramas y diagramas de dispersión para cambiar los ajustes de umbral y volver a calcular los resultados. En el QIAcuity Software Suite, puede crear informes sobre los resultados del análisis de la placa. La cuantificación absoluta es el requisito previo para todos los cálculos y análisis de segundo nivel posteriores (p. ej., análisis de detección de mutaciones, análisis de expresión génica, análisis de variación en el número de copias, etc.).
Consejos para el análisis de datos de PCR digital:
- Establezca un umbral para la clasificación de particiones positivas o negativas justo por encima del grupo de particiones negativas
- Use la muestra de NTC, solamente con particiones negativas, para facilitar el ajuste del umbral, pero también realice una inspección de todos los pocillos
- Puede establecer la amplitud de fluorescencia de los pocillos individuales ligeramente por encima o por debajo de los NTC para evitar la clasificación incorrecta de algunas particiones
- Aunque no existe consenso en cuanto al valor, normalmente se considera que una reacción es positiva cuando el número de particiones positivas es superior a 2
- Para abordar la variabilidad entre pocillos y entre lotes, use el factor de precisión de volumen (Volume precision factor, VPF) para definir el volumen exacto de cada pocillo y aplicar el factor en los cálculos de concentración por medio del software
Ejemplos de datos de PCR digital
Guía de aplicaciones de PCR digital de QIAcuity
Descubra información exhaustiva acerca de la configuración de experimentos y la ejecución de análisis de datos para aplicaciones de dPCR.
Directrices digitales MIQE (dMIQE)
Los puntos de la lista de comprobación de las directrices dMIQE se consideran fundamentales para notificar cuándo publicar los resultados de dPCR. La información que debe informarse incluye, pero no se limita a:
- Media de copias de elementos diana de ADN por partición (λ)
-
Número de particiones utilizadas (junto con la media de copias de elementos diana de ADN, estos valores pueden determinar la precisión del ensayo de dPCR)
-
Información estructural del molde, ya que la naturaleza de la muestra podría afectar la exactitud y fiabilidad de los datos:
- Tipo de molde para partición individual: genómico, plasmídico, etc.
- Origen: microrganismo, tejido, célula, alimento, planta, etc.
- Tratamiento: Digestión de restricción, sonicación, preamplificación, dilución, ninguno
- Volumen de la partición individual, ya que este volumen podría variar entre las plataformas de dPCR
- Volumen total de reacción, que se puede calcular multiplicando el número de particiones por el volumen de partición.
- Tipos de controles utilizados
- Gráficos de amplificación o valores de fluorescencia convencional representativos de datos experimentales positivos y negativos
- Ejemplo de varianza experimental, preferentemente de múltiples réplicas biológicas para capturar con mayor exactitud la incertidumbre experimental
- Otros
Documento oficial: Comprender y manejear el volumen muerto
El volumen muerto es un parámetro importante en las directrices dMIQE. Obtenga más información sobre cómo superar las limitaciones del volumen muerto para alcanzar una dPCR de alta sensibilidad.
Cómo transferir y optimizar los ensayos de qPCR a dPCR
Las consideraciones para el diseño de los ensayos de real-time PCR también se aplican a un protocolo de PCR digital. Un ensayo que genera resultados de qPCR satisfactorios también será exitoso en la dPCR. Aún se recomienda usar inicialmente concentraciones de un método de qPCR validado, pero se puede ejecutar un gradiente de concentración de primer/sonda si los valores de fluorescencia convencionales de las particiones positivas necesitan mejorar. Como se describió en las secciones anteriores, también se debe prestar atención a la compatibilidad de los fluoróforos y a las condiciones de termociclado recomendadas, así como a las concentraciones de primer/sonda para dPCR.
Parámetros de optimización del ensayo de dPCR
Sin embargo, al incorporar un nuevo ensayo, siempre se recomienda una prueba piloto inicial para evaluar el rendimiento. También se aconseja usar controles debidamente caracterizados y representativos en una matriz de fondo adecuada. El ensayo debe optimizarse para garantizar la exactitud analítica si el rendimiento es subóptimo. En tal caso, los detalles de los informes del proceso de optimización resultan fundamentales para la reproducibilidad.
Para la optimización rápida de los ensayos subóptimos, al ejecutar un gradiente térmico durante los pasos de hibridación, las mezclas maestras de QIAcuity también pueden ejecutarse en cualquier instrumento de real-time PCR.
Documento oficial: Precisión y sensibilidad en la qPCR vs dPCR
Explore los datos que comparan el rendimiento de las qPCR y las dPCR para tomar una decisión informada acerca de qué método se adapta a su aplicación.
Resolución de problemas de PCR digital
Los experimentos de dPCR pueden verse afectados por problemas similares a los de las qPCR o las PCR tradicionales o convencionales. Sin embargo, podrían surgir ciertas dificultades específicas al realizar un ensayo de PCR digital. La tabla siguiente sirve como una guía de resolución de problemas de dPCR para situaciones que suelen encontrarse en un protocolo de dPCR típico, en la que se indican las posibles causas y las recomendaciones de nuestros expertos.
Más soporte con la optimización de dPCR
Referencias
Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (accessed January 20, 2023)
Lindner L et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies. Methods. 2021; 191(4):95-106.
QIAGEN. QIAcuity User Manual Extension. June 2021.
Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012; 113(5):1014-1026.
Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020; 412:2009-2023.
The dMIQE Group and Hugget JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. 2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.