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PCR

Ingeniería de estirpes celulares

A pesar de los avances en CRISPR y otras tecnologías de ingeniería celular, la vía que va de una célula inicial a una modificada sigue siendo larga y complicada. ¿Qué ocurre si existe una manera de mejorar y acelerar su flujo de trabajo de desarrollo de estirpes celulares mientras se descubre algún cambio no intencionado en el genoma?

Descripción general

Las vulnerabilidades de la ingeniería de estirpes celulares
  • Dada la baja tasa de éxito de las técnicas de edición génica, la detección de clones editados correctamente y la caracterización de las ediciones podría tardar varios meses en completarse.
  • La edición génica, la transducción vírica o, incluso, las transfecciones rutinarias pueden causar efectos colaterales como reordenamientos cromosómicos y variantes estructurales, que a menudo pasan desapercibidos para los métodos clásicos como el cariotipo y FISH.
Una semana para:
Una semana para:
  • Transfección
  • Transducción
  • Edición génica de CRISPR
Varios meses para:
Varios meses para:
  • Selección de clones
  • Secuenciación Sanger
  • Validación de qPCR
  • Análisis de expresión genética
CRISPR y los kits QuantiNova
Varias semanas para:
Varias semanas para:
  • Evaluación de la integridad del genoma
  • Análisis de la desactivación de dianas
  • Secuenciación de ARN
Epitect HI-C Kit
No sacrifique la velocidad por la calidad; en su lugar, combine ambos aspectos en el flujo de trabajo de selección de clones y caracterización de estirpes celulares
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Enriquecimiento y selección de clones

¿Le mantiene ocupado durante semanas la detección de CRISPR?

Elimine las tareas innecesarias de su caracterización de edición génica de CRISPR. Vea el vídeo para saber cómo hacerlo.


Cómo caracterizar sus ediciones génicas de CRISPR con más rapidez y facilidad
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Caracterice las ediciones génicas de CRISPR en 3 días usando solo 10 células/µL.

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Análisis de expresión génica: valide las ediciones génicas en el nivel de transcrito usando QuantiNova PCR
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Caracterización de estirpes celulares

Revele el estado verdadero del genoma en 5 días
Vea este vídeo para descubrir un enfoque simple pero elegante para descubrir cambios genómicos no intencionados en sus células modificadas.
Identifique alteraciones cromosómicas en fases tempranas durante el desarrollo de estirpes celulares
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En comparación con los métodos clásicos, EpiTect Hi-C le proporciona una visión 10 veces más nítida del genoma, que descubre puntos ciegos genómicos, como reordenamientos cromosómicos y variantes estructurales. Más información en este folleto.

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Preguntas frecuentes

Detección de CRISPR
¿Hay algo que deba tenerse en cuenta al procesar células cultivadas en placas de cultivo recubiertas? ¿Son necesarios pasos adicionales de purificación para eliminar o reducir los reactivos de recubrimiento como la poli-L-lisina?
La preparación de muestras y la amplificación de dianas de QIAprep&amp CRISPR no se ven afectadas por los reactivos de recubrimiento. Se puede encontrar información adicional y a una lista de reactivos de recubrimiento probados en el manual de uso de QIAprep&amp CRISPR y CRISPR-Q Custom Kits en el apéndice C.
¿Hay que tener algo en cuenta cuando se trabaja con células transducidas tratadas con Polybrene?
Los productos químicos de AllTaq PCR incluidos en QIAPrep&amp CRISPR Kit son muy robustos contra los inhibidores. La preparación de las muestras no se ve afectada, y la reacción de PCR tolera hasta 1 µg/mL.
¿Los nuevos CRISPR PCR Assays pueden usarse para PCR digital (dPCR) en QIAcuity? ¿Tiene datos o un protocolo?
El CRISPR-Q Custom PCR Assay no se puede usar con dPCR. Está previsto para una ejecución de PCR convencional en un termociclador estándar, y el producto de PCR se analiza en el QIAxcel o en un gel. El CRISPR-Q Custom PCR Assay contiene 2 cebadores que flanquean el sitio de corte. El objetivo es hacer una comprobación rápida de PCR de los clones, así como preparar el molde para la siguiente secuenciación de Sanger. Para la secuenciación de Sanger, se usan los correspondientes cebadores de Sanger CRISPR-Q. dPCR para comprobar el evento de edición es una alternativa a la secuenciación de Sanger y sería específica para el evento.
EpiTect Hi-C
¿Hay puntos de detención en el flujo de trabajo de EpiTect Hi-C?
Sí. Tras los pasos de digestión de Hi-C, etiquetado del extremo de Hi-C, ligadura de Hi-C o desreticulación de cromatina en el flujo de trabajo de Hi-C Part 1, los usuarios pueden almacenar muestras a entre –15 y –25 °C, y reanudar el procedimiento en una fecha posterior.
¿Cuál es el efecto de usar cantidades de material de entrada por muestra que quedan fuera del intervalo recomendado?
Si se usan cantidades de entrada que estén fuera del intervalo de 5 x 103 y 2,5 x 106 células humanas o de ratón (o el equivalente de 30 ng–15 µg de ADN) por muestra, se corre el riesgo de repercutir en la calidad de la genoteca de secuenciación de nueva generación (NGS) resultante, ya que es probable que tenga niveles más altos de sesgo de lectura de secuencia hacia el interior (FR), extremos no ligados y pares de lecturas que contengan fragmentos de restricción contiguos y religados.
¿Puedo utilizar células que se hayan reticulado previamente y que se hayan congelado (p. ej., para un experimento de ChIP o ChIP-seq) como material de entrada para el protocolo EpiTect Hi-C?
Sí. Sin embargo, las células debería haberse reticulado con formaldehído al 1 % y no haberse congelado durante más de 6 meses.
¿Con qué plataforma puedo llevar a cabo mi secuenciación?
Las genotecas de secuenciación de EpiTect Hi-C son compatibles con todas las plataformas de secuenciación de Illumina.
¿Puedo usar mi propia gama para analizar los resultados de los experimentos de EpiTect Hi-C?
Sí. Para su análisis, dispondrá de la siguiente información adicional. La endonucleasa usada en el EpiTect Hi-C Kit se corta en sitios GATC. Los motivos de unión (o etiquetas) de Hi-C generados después de la ligadura de Hi-C consisten en una secuencia GATCGATC.
¿Con qué longitud de lectura se deberían secuenciar las genotecas de NGS de EpiTect Hi-C?
Las longitudes de lectura de 36 a 150 bp se pueden utilizar para secuenciar las genotecas de EpiTect Hi-C en secuenciadores de Illumina. Sin embargo, como la mapeabilidad aumenta con la longitud de la lectura, sugerimos utilizar lecturas de secuenciación de 2 x 150 pb para obtener los mejores resultados.
¿Proporciona QIAGEN análisis de datos para acompañar al EpiTect Hi-C Kit?
Sí. Visite el GeneGlobe Data Analysis Center en línea de QIAGEN en Hi-C Analysis (qiagen.com) para analizar sus datos con el EpiTect Hi-C Data Analysis Portal
QuantiNova RT-PCR Kit
¿Es preciso que disponga de algún equipamiento específico para analizar células cultivadas tras lisis directa si uso los QuantiNova RT-qPCR Kits?
El equipo de laboratorio estándar y los termocicladores en tiempo real son idóneos para este procedimiento. Para seleccionar ensayos idóneos, visite QuantiNova LNA Assays a través de GeneGlobe para detección basada en SYBR Green o en sondas de ARNm.
¿Cuántas células se requieren para comprobar los niveles de expresión génicas de mis genes editados en PCR directa?
Los kits de RT-qPCR de un paso QuantiNova pueden detectar ARNm incluso en células simples. Sin embargo, se debe tener en cuenta la abundancia esperada del gen editado de interés para seleccionar una cantidad adecuada de células. Se recomienda usar hasta 2000 células por recipiente de reacción de PCR.
¿Qué estirpes celulares son idóneas para lisis directa y RT-qPCR?
Se han usado con éxito diversas estirpes celulares en el protocolo de PCR directa descrito, y deberían ser aptas para el procedimiento todas las utilizadas habitualmente.
¿Es preciso lavar las células antes de la lisis directa y RT-qPCR?
Sí, tanto el material extracelular como los restos y el material intracelular de las células muertas, incluidos el ARN o las RNasas y las proteasas, se liberarán en el cultivo celular y pueden interferir con la RT-PCR. Recomendamos encarecidamente la eliminación mediante lavado de las células con medio de cultivo celular.
¿Es necesario preparar la reacción de RT-PCR en hielo?
No, los QuantiNova qRT-PCR Kits utilizan una qRT-PCR bifásica de un solo paso que mantiene tanto la transcriptasa inversa como la Taq polimerasa inactivas a temperatura ambiente, lo que permite una cómoda preparación a temperatura ambiente sin poner en riesgo el rendimiento.