Flujo de trabajo y productos de PCR digital

Puede consultar nuestra guía de aplicación de QIAcuity para obtener instrucciones detalladas y tutoriales paso a paso sobre cómo configurar experimentos de PCR digitales. También nos gustaría remitirle a las directrices MIQE para PCR digital y su más reciente actualización (Huggett JF et al, 2013 y 2020), donde se identifican algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de configurar resultados de experimentos de PCR digital y elaborar informes a partir de estos.

QIAcuity lee las fluorescencias que se emiten en la base de la placa, que está recubierta por una película. Para obtener mejores resultados, le recomendamos mantener la película limpia y evitar dañarla con las uñas. También es importante que mantenga el código de barras del lado de la placa limpio e intacto. No olvide manipular las placas con guantes y no les aplique fuerza. Para una manipulación segura, coloque la placa en su base de trasporte de nanoplacas.

El software de su sistema de dPCR probablemente le proporcionará análisis de primer y segundo nivel. Los análisis de primer nivel podrían incluir un diagrama de concentración, una vista de las particiones en los pocillos de interés o un mapa de calor para comparar el canal de la diana con un canal de referencia. Puede usar los histogramas y los diagramas de dispersión para cambiar los ajustes de umbral. En el análisis de segundo nivel, puede analizar datos de PCR de acuerdo con los objetivos de la aplicación (detección de mutaciones, análisis de expresión génica, etc.).

El diseño de cebadores para PCR digital es similar al diseño de cebadores para qPCR. Debe prestar atención a la complementaridad con el molde diana, la composición básica, la longitud del amplicón, la temperatura de fusión, las estructuras secundarias, la autocomplementariedad e intercomplementariedad (autohibridación) y la complementaridad cruzada. Una diferencia es que los cebadoress para dPCR suelen utilizarse en concentraciones más altas que la qPCR para separar mejor señales específicas del ruido de fondo.

Para la mayoría de las aplicaciones de QIAcuity dPCR, el ADN del molde se distribuye de manera uniforme a través de las cámaras de reacción de QIAcuity Nanoplate. En las reacciones de QIAcuity con productos de PCR o ADN altamente fraccionado (ADN de FFPE, ADN circulante libre), ADN complementario (cADN), gBlocks, etc., como molde, se observará una distribución uniforme de la señal de PCR. Sin embargo, las moléculas de ADN de más de 20 kb o los plásmidos se dividen de manera irregular, lo que da lugar a una sobrecuantificación de la concentración de moldes. Al añadir enzimas de restricción a las mezclas de reacción de QIAcuity, los moldes de gran tamaño pueden fragmentarse en tamaños más pequeños, lo que da lugar a una distribución uniforme en los moldes y una cuantificación precisa. Esto es especialmente importante en los análisis de variación del número de copias (copy number variation, CNV), en los que se asocian varias copias de un gen en tándem. Cuando se añaden enzimas de restricción a las mezclas de reacción, los usuarios deben asegurarse de que las enzimas no corten dentro de la secuencia de amplicón. Se recomienda incluir la enzima de restricción en la mezcla maestra e incubarla durante 10 minutos a temperatura ambiente tras añadir el molde.

El instrumento de dPCR de QIAcuity puede detectar fluoróforos como FAM, EvaGreen, VIC, HEX, TAMRA, ROX y Cy5. 

Todas las muestras de ADN que se utilizan en mezclas de reacción deben mostrar calidad y cantidad similares, lo que se puede analizar fácilmente mediante espectrofotometría de UV. Las muestras de ADN de una longitud media de ≥20 kb (por ejemplo, ADN genómico purificado mediante columna de centrifugación con membrana de gel de sílice) deberá fragmentarse mediante digestión de restricción antes de particionar La fragmentación enzimática de ADN de mayor tamaño garantiza una distribución uniforme del molde en la QIAcuity Nanoplate, lo que a su vez da lugar a una cuantificación precisa y exacta.