miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays para PCR digital

• Diseñe sus propios juegos de cebadores de PCR digital mejorados con LNA para cualquier miARN
• La sensibilidad incomparable permite la cuantificación de miARN a partir de solo 1 pg de ARN total
• La alta especificidad discrimina los miARN relacionados estrechamente y los miARN maduros de los precursores
• Protocolo de dPCR de dos pasos rápido y sencillo que dura menos de 3 horas
• Cuantificación absoluta de cambios de expresión de miARN con dPCR mediante el uso del instrumento QIAcuity y el QIAcuity EG PCR Kit

Los miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays son juegos de cebadores de PCR de miARN que permiten una cuantificación sumamente sensible y específica del miARN. Los cebadores para la amplificación de PCR directa e inversa son específicos para el miARN y están optimizados con la tecnología LNA. Estos ensayos se proporcionan en formato de tubo y contienen suficientes cebadores para 166 reacciones en una Nanoplate 8.5k (12 μl por reacción) o para 50 reacciones en una Nanoplate 26k (40 μl por reacción). El paso de la síntesis del ADNc previo se realiza con el miRCURY LNA RT Kit, mientras que la amplificación por PCR digital se lleva a cabo en el instrumento QIAcuity con el QIAcuity EG PCR Kit.

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Análisis optimizado de PCR con los QIAcuity EG PCR Kits y el instrumento QIAcuity

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays se desarrollaron para ofrecer amplificación de dianas de alta especificidad. Esto puede cuantificarse mediante dos métodos de PCR: qPCR con termocicladores en tiempo real estándar y PCR digital con el instrumento QIAcuity y el QIAcuity EG PCR Kit. Tras la síntesis de ADNc con el miRCURY LNA RT Kit, la PCR digital ofrece cuantificación de dianas de gran precisión, que permite detectar hasta los cambios de expresión más pequeños en las concentraciones más bajas. En el instrumento QIAcuity se ha validado experimentalmente un subconjunto de miARN clave.

LNA mejora el rendimiento de la PCR

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays han sido desarrollados con los criterios de diseño y los algoritmos validados por los laboratorio más exigentes. El riguroso proceso de selección de ensayos garantiza que cada juego de cebadores ofrezca la más alta especificidad y eficacia para obtener los resultados más fiables y exactos. La normalización de T_m y la mejora de LNA ortogan a los cebadores una mayor afinidad de unión que los cebadores de ADN estándar, lo que aumenta drásticamente la sensibilidad y la especificidad del ensayo.

En comparación con otros sistemas de PCR de miARN que utilizan cebadores en horquilla o de ADN estándar, los cebadores mejorados con LNA ofrecen una sensibilidad significativamente mayor, especialmente para los miARN ricos en AT.

El proceso de diseño

La herramienta de diseño del miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assay le permite diseñar con más facilidad juegos de cebadores de PCR mejorados con LNA muy sensibles y específicos para cualquier miARN que no esté disponible como producto diseñado previamente. El algoritmo avanzado evalúa aproximadamente 3000 diseños de pares de cebadores basados en más de 60 criterios distintos para encontrar los juegos de cebadores de LNA óptimos para su miARN en pocos minutos. La herramienta se ha diseñado para los miARN pero también puede utilizarse para ARN pequeños de 14–27 nucleótidos de longitud.
Los criterios del diseño incluyen:

• Optimización de las temperaturas de disociación mediante la variación de la distribución del LNA de los cebadores para garantizar la alta eficiencia de amplificación y la especificidad.
• Cálculos y ajustes de las puntuaciones de autohibridación e hibridación cruzada para reacciones de PCR eficientes.
• Ajustes para evitar la posible formación de dímeros de cebador en la reacción de PCR.
• Posicionamiento inteligente de las bases de LNA en los cebadores de acuerdo con nuestro amplio conocimiento del diseño de oligonucleótidos de LNA.
• Búsquedas en miRBase para identificar posibles miARN con gran similitud de secuencia. Esto garantiza que los juegos de cebadores sean muy específicos para el ARN pequeño para el que fueron diseñados.

Un sistema único para la creación de perfiles de miARN

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays ofrecen la mejor combinación de rendimiento y facilidad de uso en el mercado de PCR de microARN al combinar una RT universal con la amplificación mediante PCR de LNA (consulte la figura  Esquema del sistema de PCR digital de miRCURY LNA miRNA). La RT universal permite utilizar una reacción de síntesis de la primera hebra de ADNc como molde para varios ensayos de PCR en tiempo real de miARN. Esto ahorra muestras valiosas, reduce la variación técnica y ahorra tiempo en el laboratorio. Además, los cebadores de amplificación de la PCR tanto directa como inversa son específicos de miARN y están optimizados con LNA. Esto proporciona 1) una sensibilidad excepcional y un fondo sumamente bajo, lo que hace posible la cuantificación precisa de niveles de miARN muy bajos, y 2) ensayos muy específicos que permiten la discriminación entre secuencias de miARN estrechamente relacionadas.

El principio de la reacción de dPCR en las QIAcuity Nanoplates se describe aquí.

Ensayos de genes de referencia para la normalización

Hay disponibles cinco juegos de cebadores de genes de referencia validados para la dPCR, que permiten una normalización de los datos de alta calidad y generar datos fiables a partir de varios tipos de muestras diferentes (consulte la tabla siguiente). Estos juegos de cebadores de control se dirigen a pequeños ARN sin codificación y endógenos que se expresan de forma constitutiva y relativamente estable en los distintos tejidos humanos (consulte la figura  Niveles de expresión de genes de referencia en distintos tejidos humanos). Los genes de referencia de control ofrecen la posibilidad de normalizar de forma exacta y fiable una variedad de niveles de expresión de miARN. Para obtener más información, consulte la página miRCURY PCR Controls.

Lista de ensayos de genes de referencia disponibles

* Validado para el uso en PCR digital.

Flujo de trabajo simple y rápido basado en la placa

Las funciones de división en partes, termociclado y obtención de imágenes están integradas en un solo instrumento completamente automatizado que produce resultados en menos de dos horas. Los formatos de nanoplaca son susceptibles a la automatización inicial para la preparación de las muestras, lo que reduce aún más el tiempo de manipulación.
Como en el caso de los experimentos de qPCR, la preparación de las muestras incluye la transferencia de muestras diluidas y la adición de la mezcla maestra y los cebadores a una nanoplaca de 96 o 24 pocillos. El sistema integra funciones de división en partes, termociclado y obtención de imágenes en un solo instrumento completamente automatizado que permite a los usuarios obtener los resultados de las muestras en menos de 3 horas. Es posible realizar un análisis remoto en el paquete de software, que proporciona la concentración en copias por microlitro de las secuencias dianas y también opciones incorporadas para el control de calidad.

Los miRCURY LNA miRNA PCR Assays, en conjunto con el QIAcuity Digital PCR System, permiten el análisis de PCR digital para la cuantificación del miARN maduro.