Marcaje de ácidos nucleicos

La ADN Polimerasa I, codificada por el gen polA, fue la primera ADN polimerasa descubierta y es la polimerasa más abundante en E. coli (aproximadamente 400 moléculas por célula). Es un ejemplo de una enzima procesiva ya que puede catalizar secuencialmente varios pasos de polimerización sin liberar el molde monocatenario. El polipéptido tiene dos dominios funcionales: un dominio amplio (Klenow Fragment) que contiene polimerasa 5'→3' y exonucleasa de corrección de errores 3'→5', y un fragmento pequeño que contiene actividad de exonucleasa 5'→3'. La segunda actividad permite a la ADN polimerasa I eliminar los primers de ARN empleados para iniciar el fragmento de Okazaki en pasos posteriores. Las funciones principales de la polimerasa in vivo son participar en la recombinación y la reparación del ADN. Durante la reparación de ADN, la ADN polimerasa I completa los espacios de ADN que resultan de la eliminación de lesiones de ADN. 

Las aplicaciones en investigación incluyen el desplazamiento de la muesca (Nick translation) dependiente de la DNasa I, la síntesis de la segunda cadena en la clonación de ADNc y el complemento de salientes de 5´. La ADN Polimerasa I incorpora nucleótidos biotinilados.

La actividad de exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I de E. coli la convierte en no apta para muchas aplicaciones. El Klenow Fragment, el dominio amplio que contiene polimerasa 5'→3' y exonucleasa de corrección de errores de 3'→5', carece de esta actividad, lo que le confiere útiles aplicaciones de investigación, entre las que se incluyen la síntesis de ADN bicatenario a partir de moldes monocatenarios, el complemento de los extremos 3' retraídos de fragmentos de ADN para que los salientes 5' sean romos, la digestión de los salientes 3' que sobresalen y la preparación de sondas de ADN marcadas. 

Del mismo modo que la actividad de exonucleasa 5'→3' de la ADN polimerasa I de E. coli puede ser indeseable, la actividad de exonucleasa 3'→5' de Klenow Fragment también puede ser indeseable para ciertas aplicaciones. Este problema se resuelve introduciendo mutaciones que den como resultado una enzima Klenow Fragment (3'→5' exo-) que conserva la actividad de polimerasa 5'→3', pero carece de actividad de exonucleasa. Klenow Fragment (3'→5' exo-) se usa en algunas reacciones de marcaje fluorescente para microarreglos y en la adición de bases dA y dT, un paso importante en el proceso de ligación de adaptadores ADN a fragmentos de ADN, frecuentemente usados en la preparación de librerías de ADN para secuenciación de última generación

La ADN polimerasa T7 por sí misma tiene una baja procesividad. Se disocia de un complejo molde-primer tras la incorporación <15 nt. Ante una infección por E. coli, el bacteriófago T7 anexa una proteína huésped, la tiorredoxina, para que sirve como su factor de procesividad. La T7 ADN polimerasa y la tiorredoxina se unen en un complejo uno a uno, en consecuencia, la unión de la tiorredoxina a T7 ADN polimerasa aumenta 80 veces la afinidad de la polimerasa específicamente a un complejo molde-primer. Una consecuencia del aumento de la afinidad de un molde de primer es la capacidad de la T7 ADN polimerasa de extender un primer sobre ADN monocatenario en miles de nucleótidos sin disociación, lo que permite una síntesis continua de largas extensiones de ADN. La T7 DNA polimerasa se puede usar para la purificación de ADN circular cerrado de forma covalente mediante la eliminación de ADN genómico residual, así como para la síntesis de las cadenas de ADN complementario. 

La Poli(A) Polimerasa o polinucleótido-adenilil-transferasa, cataliza la incorporación de residuos de adenina en los extremos 3’ de ARN mediante el uso de ARN monocatenario como primer y la eficaz adición de una secuencia de poli(A) al ARN. La poli(A) polimerasa es una polimerasa independiente del molde que pertenece a la gran superfamilia de nucleotidil transferasas de la familia X que también incluye la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT).

La poliadenilación es un paso fundamental en la maduración del ARNm; las colas de poli(A) en el extremo 3’ de ARNm facilitan el transporte de ARNm desde el núcleo, mejoran la eficiencia traslacional y aumentan la longevidad del ARNm en el citoplasma. En las eucariotas, el aparato responsable de la poliadenilación está físicamente acoplado con el de la escisión de ARNm. La generación del extremo 3’ poliadenilado de un ARNm requiere una escisión endonucleolítica antes del poliadenilado del pre-ARNm por acción de la poli(A) polimerasa. 

En la biología molecular, la adición de una secuencia de poli(A) con poli(A) polimerasa mejora el desplazamiento del ARN que se transfiere a células eucariotas. Otras aplicaciones incluyen la adición de la secuencia de poli(A) del ARN para clonación o la purificación de afinidad y el etiquetado de 3’ de ARN con ATP o el análogo de nucleósido, cordicepina (3’-desoxiadenosina).