Enzymes, NGS, Black male pipetting in front of computer screen in a laboratory environment
Enzimas para biología molecular

Análisis de ARN

Todo sobre el ARN: amplificar, secuenciar, ligar y etiquetar

Existe un conjunto de enzimas que permiten manipular el ARN para el análisis anterógrado de la expresión genética. Las transcriptasas inversas generan ADN complementario (ADNc) de un transcrito. El ADNc se puede etiquetar o amplificar para clonación o estudios cuantitativos. Las ARN ligasas unen bases, etiquetas y adaptadores, las polimerasas añaden ribonucleótidos de ARN y las ribonucleasas los eliminan. 

Detectar y manipular el ARN mediante la amplificación

Las transcriptasas inversas son enzimas capaces de polimerizar una hebra de ADN (ADNc) que sea complementaria a un molde original de ARN. El ARN se puede degradar por la acción de las RNases y el uso de una enzima de transcriptasa inversa para producir ADNc resuelve los problemas de trabajar con ARNm. El ADNc se convierte en el molde estable en una variedad de aplicaciones anterógradas para los estudios de ARN, como el análisis de la expresión genética. Se pueden utilizar una PCR normal, una qPCR, una RT qPCR en un solo paso o métodos isotérmicos para amplificar el molde de ADNc. Tras la amplificación, se puede realizar una clonación con protocolos convencionales de enzimas o una clonación independiente de la ligación utilizando la actividad de exonucleasa de 3’→5’ de la ADN polimerasa T4. 

Todas las enzimas de transcriptasa inversa (ADN polimerasas dependientes de ARN) se pueden utilizar para:

    RNase H (+/−)
 Aplicaciones especializadas
P7600L
EnzScript		 Próximamente  Menos Para ADNc largos y genotecas con un alto porcentaje de ADNc de longitud completa, aplicaciones que requieren cambio de molde, es decir, secuenciación de ARN
P7720L
StableScript		 Próximamente

Menos

Para ADNc largos, procesabilidad mejorada, resistencia a inhibidores y termoestabilidad (temperatura óptima de 55 °C)
205111
Omniscript Kit
 Más Marcaje para microarreglos; especialmente diseñados para trascripción reversa
con cualquier cantidad de ARN; buffer optimizado; sin necesidad del paso con RNase H.

ARN polimerasas y ligasas

Las ARN polimerasas o, más concretamente, las ARN polimerasas dirigidas por ADN, son enzimas que sintetizan el ARN a partir de un molde de ADN. La enzima polimerasa poli(A) utiliza ARN monocatenario como primer para añadir una cola de poli(A) al ARN catalizando la incorporación de residuos de adenina en los extremos 3’ de ARN. 

Las ARN ligasas T4 son enzimas útiles para los análisis de RNA, en particular previos a procedimientos como la secuenciación de ARN de alto rendimiento y las micromatrices. Las ARN ligasas T4 1 y 2 son enzimas que pueden etiquetar, circularizar o llevar a cabo una ligadura intermolecular de ARN uniendo polinucleótidos adyacentes 3'-OH y 5'-PO4. La unión de los adaptadores a los extremos 3' de ARN con la ARN ligasa T4 1 es un primer paso útil para la cuantificación y el descubrimiento de ARN mediante RT-PCR y secuenciación de alto rendimiento.

    Acción Aplicaciones
P7180L
T7 RNA Polymerase		 Próximamente  Sintetiza ARN en la dirección 5’→ 3’ a partir del molde de ADN; específico para el promotor de T7
  • Síntesis de ARNm in vitro
  • Etiquetado de sondas de ARN
  • Generación de ARN para estudios de ARN
  • Control de expresión mediante ARN antisentido
  • Síntesis de ARN guía (sgRNA)
P7460L
Poly(A) Polymerase		 Próximamente

Cataliza la adición de AMP de ATP al 3’-OH de ARN para ARN con cola de poli(A)
  • Etiquetado de 3' de ARN con ATP o cordicepina
  • Addición de cola de poli(A) a ARN
  • La cola de poli(A) mejora la traducción del ARN transferido a células eucariotas
 L6050L
T4 RNA Ligase 1		 Próximamente ARN ligasa monocatenario; también une moléculas de ADN monocatenario
  • Ligadura de ARN o ADN monocatenario
  • Etiquetado del extremo 3' de ARN o ADN monocatenario
L6080L
T4 RNA Ligase 2 		 Próximamente Ligadura de mellas en ARNbc (Ligation of nicks in dsRNA); puede ligar el 3’-OH de ARN al 5’-PO4 de ADN en híbridos bicatenarios
  • Unión con molde de varios oligonucleótidos
  • Síntesis de ARN que contienen modificaciones o etiquetas específicas de un lugar
  • Ligadura de mellas del ARNbc (nick ligation of dsRNA)
  • Ligadura de 3’-OH de ARN a 5’-PO4 de ADN en un ADN/ARN doble

L6070L
T4 RNA Ligase 2
(truncada) 

 Próximamente Cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un fosfato 5’ sometido previamente a adenilación (ADN o ARN) y el hidroxilo 3’ de ARN
  • Ligaduras de conector con 5’ de ADN sometido previamente a adenilación a hidroxilo 3’ de ARN
  • Clonación y secuenciación de ARN pequeños

Digestión y protección de ARN

El ensayo de protección de ribonucleasas (ribonuclease protection assay, RPA) con la enzima RNase A es un técnica utilizada para determinar la abundancia relativa o absoluta del transcrito y para identificar los extremos del ARNm y los límites entre intrones y exones.

Las sustituciones de una única base se pueden detectar y localizar mediante un sencillo método enzimático que implica la escisión de la RNase A de las discordancias en los heterodúplex de ARN:ADN.

    Acción Aplicaciones
19101
RNase A		    Endorribonucleasa que degrada el ARNmc en residuos C y U*
  • Determinación de abundancia relativa o absoluta de los transcritos
  • Identificación de los extremos de ARN y los límites entre intrones y exones (RPA)
  • Identificación de mutaciones de una única base en ADN o ARN
  • Extracción de ARN de preparaciones de plásmidos y ADN genómico
  • Extracción de ARN de preparaciones proteínicas recombinantes
Y9220L
RNase H		 Próximamente Endorribonucleasa que hidroliza los enlaces fosfodiéster
de ARN hibridizado a ADN		 La actividad de la RNase H degrada el molde de ARN de un complejo de ADN:ARN liberando ADNc monocatenario como molde para la síntesis del ADNc de segunda hebra
Y9240L
RNase Inhibitor		 Próximamente Inhibidor no competitivo de la RNase A, B, C de origen porcino; no inhibe la actividad de la RNase H. Protege al ARN frente a la degradación; se suele usar como medida de precaución en las manipulaciones enzimáticas del ARN
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