La dPCR pour les débutants

Évolution de la dPCR

Les questions complexes que soulève actuellement la recherche exigent des informations d’une précision que les technologies de PCR classiques sont incapables de fournir. La PCR digitale de troisième génération résout ce problème, elle devient une technique plus simple et plus pratique qui permet de répondre aux questions de la recherche au quotidien.

Le concept même de PCR digitale remonte à peu près à 1992, lorsque Sykes et al. l’ont décrite comme une « PCR à dilution limitative ». Cette méthode générale utilisait l’analyse en point final et la loi de Poisson pour quantifier le nombre absolu de molécules d’acide nucléique dans un échantillon. Vogelstein et Kinzler ont ensuite révolutionné la discipline en 1999 : ils ont développé une méthode consistant à diluer et répartir l’échantillon en réactions individuelles appelées fractions, puis des produits individuels avec signaux de fluorescence sont détectés et analysés après amplification. Ils ont ainsi inventé le terme de « PCR digitale » que nous connaissons aujourd’hui.

Avec les années, ces méthodes ont été perfectionnées et commercialisées pour être adoptées par le plus grand nombre. On peut utiliser la PCR digitale sur des puces ou disques microfluidiques, des puces à ADN et des micro-gouttelettes ou des cristaux de gouttes issus d’émulsions d’huile et d’eau et, depuis peu, sur des plaques de type qPCR.

La PCR digitale est une approche de grande précision, permettant la détection et la quantification des acides nucléiques de manière sensible et reproductible. Les mesures sont effectuées en divisant l’échantillon en fractions de sorte qu’il y ait soit aucune, soit une seule, soit plusieurs molécules cibles présentes dans toute réaction individuelle. Chaque fraction est analysée après un cycle de PCR en point final afin de déterminer la présence (réaction positive) ou l’absence (réaction négative) d’un signal de fluorescence, puis le nombre absolu de molécules présentes dans l’échantillon est calculé. La quantification de la cible de l’échantillon ne nécessite pas de courbe d’étalonnage. La courbe d’étalonnage n’étant plus nécessaire, cela réduit les erreurs et améliore la précision.

Diviser pour mieux régner

Tandis que l’échantillon est préparé ainsi pour la qPCR, le fractionnement d’échantillon, dans lequel un échantillon est divisé en milliers de réactions individuelles avant amplification, est propre à la PCR digitale. En répartissant aléatoirement les molécules dans les fractions, contrairement à l’analyse globale en qPCR, la PCR digitale limite les effets des cibles concurrentes et améliore la précision et la sensibilité de la détection des événements rares.

Elle permet aux chercheurs de :

• Quantifier les cibles peu abondantes ou les cibles sur un fond complexe
• Détecter et distinguer les variants alléliques (SNP)
• Surveiller les changements de moindre ampleur dans les niveaux de cibles, qui sont indétectables à la qPCR

La loi de Poisson donne tout son sens au fractionnement

Contrairement à la qPCR en temps réel, la PCR digitale ne dépend pas de chaque cycle d’amplification pour déterminer la quantité relative de molécules cibles, elle se base plutôt sur la loi de Poisson pour déterminer la quantité cible absolue après une amplification en point final.

Dans la mesure où la molécule cible est répartie aléatoirement sur l’ensemble des fractions disponibles, la loi de Poisson permet d’estimer le nombre moyen de molécules par fraction (aucune, une ou plusieurs) et de calculer les copies de molécule cible par fraction positive. L’analyse statistique suivant la loi de Poisson du nombre de réactions positives et négatives donne une quantification absolue précise de la séquence cible.