PCR et amplification d’ADN

La Taq ADN polymérase appartient à la famille A des polymérases, un groupe d’enzymes reliées qui comprend des polymérases de réparation bactériennes et la plupart des polymérases réplicatives bactériophages. En général, les polymérases de la famille A présentent une activité à la fois réplicative et réparatrice. La fonction de « correction » importante qui permet la réparation d’un nucléotide mal apparié est assurée par l’activité de l’exonucléase 3’→5’, et l’activité de l’exonucléase 5’→3’ permet l’extraction des amorces d’ARN. Dans la Taq polymérase, le domaine de correction de l’exonucléase 3’→5’ a été modifié, il n’est pas fonctionnel.

La PCR impose à une polymérase les mêmes exigences qu’une cellule sur son système de réplication : fiabilité, précision (ou fidélité), vitesse et processivité. La précision, ou fidélité, de la polymérase concerne l’intégration des nucléotides corrects spécifiés par le brin matriciel. Les ADN polymérases assurent une réplication de précision grâce à une série de points de contrôle moléculaires sur le site d’intégration des nucléotides. La Taq polymérase standard est assez précise avec un taux d’erreur global relativement faible, mais est dépourvue d’activité de « correction » de l’exonucléase 3’→5’, cela limite la taille d’amplicon possible effective de l’enzyme. La Taq fonctionne au mieux, c’est une enzyme résistante, facilement optimisée, lors de l’amplification de fragments d’ADN < 2 kb. Cette enzyme peut fonctionner avec des fragments jusqu’à 3–4 kb, mais son efficacité diminue rapidement avec des amplicons supérieurs à 3 kb.

La PCR hot start est facilitée par les modifications apportées à l’ADN polymérase qui bloquent l’amplification en rendant l’enzyme inactive tant que la température n’est pas plus importante. Les éléments de modification courants comprennent l’interaction d’anticorps, la modification chimique et la technologie avec aptamère. Une fois les températures permettant la réaction atteintes pendant le cycle de PCR, l’inhibiteur se détache de la polymérase et la polymérisation commence.

Les anticorps anti-Taq ADN polymérase liés à l’enzyme inactivent l’enzyme en se liant à la polymérase, ce qui empêche l’amplification précoce de l’ADN à faibles températures. Une fois que la température de renaturation optimale est atteinte, les anticorps commencent à se dégrader et à se détacher, libérant ainsi la Taq ADN polymérase dans la réaction et initiant le processus d’amplification.

Les Taqs ADN polymérases modifiées chimiquement ont des groupes de blocage thermolabiles attachés à des résidus d’acides aminés spécifiques. Ces groupes sont extraits par une étape initiale d’activation à haute température dans la réaction de PCR. Cela rétablit la pleine activité de la Taq ADN polymérase et le cycle de PCR peut continuer.
La PCR hot start avec aptamère est basée sur l’inhibition de la fonction de la Taq ADN polymérase par la fixation des aptamères de type oligonucléotide. Les aptamères se détachent de l’enzyme à une température plus faible que les groupes de blocage chimique thermolabiles ou que les anticorps, ainsi l’étape d’activation à haute température est inutile et les protocoles de PCR sont plus rapides. De plus, l’inhibition basée sur les aptamères est entièrement réversible de sorte que l’activité de la Taq ADN polymérase soit également bloquée à la fin du thermocyclage.