miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays pour la PCR numérique

• Concevez vos propres jeux d’amorces de PCR numérique améliorée par des LNA pour tout miARN
• La sensibilité inégalée permet la quantification des miARN à partir de seulement 1 pg d’ARN total
• La spécificité élevée distingue les miARN très proches et les miARN matures des précurseurs
• Le protocole de dPCR rapide et simple en deux étapes dure moins de 3 heures
• La quantification absolue de l’expression des miARN change avec la dPCR à l’aide de l’instrument QIAcuity et du QIAcuity EG PCR Kit

Les miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays sont des jeux d’amorces de PCR de miARN personnalisés permettant une quantification du miARN extrêmement sensible et spécifique. Les amorces d’amplification par PCR sens et antisens sont spécifiques du miARN et optimisés avec la technologie LNA. Les dosages sont fournis sous forme de tube et contiennent suffisamment d’amorces pour 166 réactions dans une Nanoplate 8.5k (12 μl par réaction) ou 50 réactions dans une Nanoplate 26k (40 μl par réaction). L’étape de synthèse de l’ADNc en amont est effectuée avec le miRCURY LNA RT Kit, alors que l’amplification par PCR numérique se fait sur l’instrument QIAcuity avec le QIAcuity EG PCR Kit.

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Analyse de PCR numérique optimisée avec les QIAcuity EG PCR Kits et l’instrument QIAcuity

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays ont été développés pour permettre une amplification des cibles avec une grande spécificité. Cela peut être quantifié par deux méthodes de PCR : la qPCR avec des thermocycleurs classiques et PCR numérique à l’aide de l’instrument QIAcuity et du QIAcuity EG PCR Kit. Après la synthèse de l’ADNc à l’aide du miRCURY LNA RT Kit, la PCR numérique permet une quantification des cibles très précise, assurant la détection d’infimes changements d’expression aux concentrations les plus faibles. Un sous-ensemble des principaux miARN a été validé expérimentalement sur l’instrument QIAcuity.

Performances de la PCR améliorées par des LNA

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays ont été développés à l’aide de critères de conception rigoureux et d’algorithmes validés en laboratoire. Le processus rigoureux de sélection des dosages garantit que chaque jeu d’amorces offre les plus grandes spécificité et efficacité pour obtenir les résultats les plus fiables et exacts que possible. La normalisation des T_m et l’amélioration par des LNA confèrent aux amorces une affinité de liaison plus élevée que les amorces d’ADN classiques, augmentant considérablement la sensibilité et la spécificité des dosages.

Par rapport aux autres systèmes de PCR miARN utilisant des amorces d’ADN standard ou tige-boucle, les amorces améliorées par des LNA offrent une sensibilité significativement accrue, surtout pour les miARN riches en AT

Le processus de conception

L’outil de conception de miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assay vous permet de concevoir facilement des jeux d’amorces de PCR améliorés par des LNA hautement sensibles et spécifiques pour tout miARN non couvert par un produit préconçu. L’algorithme avancé évalue environ 3 000 conceptions de paires d’amorces sur la base de plus de 60 critères différents pour trouver des jeux d’amorces optimaux de LNA pour votre miARN en quelques minutes. L’outil a été conçu pour les miARN, mais peut aussi être utilisé pour d’autres ARN d’une longueur de 14–27 nucléotides.
Les critères de conception incluent :

• Optimisation des températures de fusion en variant la distribution de LNA des amorces afin d’assurer une efficacité et une spécificité de l’amplification élevées.
• Calculs et ajustements des scores d’auto-hybridation et d’hybridation croisée pour des réactions de PCR efficaces.
• Ajustements pour éviter une formation potentielle de dimère d’amorces dans la réaction de PCR.
• Positionnement intelligent des bases des LNA dans les amorces sur la base de nos vastes connaissances en matière de conception d’oligonucléotides du LNA.
• Recherches de miRBase pour identifier les miARN potentiels avec une similitude de séquence élevée. Cela garantit que les jeux d’amorces sont hautement spécifiques pour le petit ARN peur lequel ils ont été conçus.

Un système unique pour le profilage des miARN

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays offrent la meilleure combinaison de performance et de facilité d’utilisation sur le marché de la PCR microARN en combinant le RT universel avec l’amplification par PCR LNA (voir figure  Plan schématique du système de PCR numérique miRCURY LNA miRNA). Le RT universel permet d’utiliser une réaction de synthèse du premier brin d’ADNc comme modèle pour plusieurs dosages de PCR en temps réel de miARN. Ceci économise des échantillons précieux, réduit la variation technique et fait gagner du temps au laboratoire. En outre, les amorces d’amplification par PCR sens et antisens sont spécifiques du miARN et optimisés par des LNA. Cela donne 1) une sensibilité exceptionnelle et un fond extrêmement bas, permettant une quantification précise de taux de miARN très faibles et 2) des dosages hautement spécifiques permettant de distinguer des séquences de miARN très proches.

Vous trouverez ici une description du principe de la réaction de dPCR sur QIAcuity Nanoplates.

Dosages de gènes de référence pour la normalisation

Cinq jeux d’amorces de gène de référence validés sont disponibles pour la dPCR, permettant une normalisation des données de haute qualité et de générer des données fiables de nombreux types d’échantillons différents (voir tableau ci-dessous). Ces jeux d’amorces de contrôle ciblent de petits ARN non codants endogènes, exprimés de manière constitutive et relativement stable dans différents tissus humains (voir figure  Niveaux d’expression des gènes de référence dans différents tissus humains). Les gènes de référence de contrôle permettent une normalisation précise et fiable sur divers niveaux d’expression de miARN. Pour plus d’informations, reportez-vous à la page Contrôles de PCR miRCURY.

Liste des dosages de gènes de référence disponibles

* Validé pour l’utilisation dans la PCR numérique.

Une méthode sur plaques simple et rapide

Le partitionnement, le thermocyclage et l’imagerie sont intégrés dans un seul instrument entièrement automatisé, produisant des résultats en moins de deux heures. Les formats sur nanoplaque permettent l’automatisation frontale pour la préparation des échantillons, réduisant ainsi le temps de manipulation.
Tout comme les expériences de qPCR, la préparation des échantillons inclut le transfert d’échantillons dilués et l’ajout de mélange principal et d’amorces dans une nanoplaque à 96 ou 24 puits. Le système intègre le partitionnement, le thermocyclage et l’imagerie dans un seul instrument entièrement automatisé qui permet aux utilisateurs de passer de l’échantillon aux résultats en moins de 3 heures. Il est possible d’effectuer l’analyse à distance à l’aide de la suite logicielle, qui donne la concentration des séquences cibles en copies par microlitre et des options de contrôle qualité intégrées.

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays, en combinaison avec le QIAcuity Digital PCR System, permettent une analyse de PCR numérique pour la quantification du miRNA mature.