Clonage et recombinaison d’ADN

Extrémité cohésive ou franche : modification, renaturation et ligature

Les technologies de clonage et de recombinaison d’ADN ont permis de développer grandement nos connaissances de la manipulation des gènes et des cellules en matière de santé et de maladie. Les techniques et applications de clonage ont fait un bond en avant grâce à des applications innovantes telles que l’assemblage à haut débit d’échantillothèques et la cartographie de modifications épigénétiques.

Enzymes pour le clonage

Une modification terminale de l’extrémité peut être nécessaire avant de pouvoir cloner l'ADN matriciel en un vecteur plasmidique adapté. L’ADN identifié pour le clonage est généralement isolé à partir de la source par digestion d’enzymes de restriction ou amplification par PCR. Des enzymes spécifiques, telles que le fragment de Klenow, l’ADN polymérase T4 et la polynucléotide kinase T4, modifient les extrémités 3’ ou 5’ afin d’améliorer la liaison covalente entre les fragments d’ADN et le vecteur.

L’étape suivante du clonage est la ligature à une enzyme adaptée à la renaturation des extrémités du vecteur et de l’insert.

Une extension homopolymérique permet en général de préparer un vecteur T à utiliser dans un clonage TA ou d’ajouter une queue A à un produit de PCR issu d’une polymérase haute fidélité (autre que Taq) à utiliser dans un clonage TA. Les produits de l’amplification par Taq ADN polymérase ont déjà une queue A.

Enzymes pour modification terminale d’ADN

Enzyme	Modification terminale
	Remplissage d’extrémité 5’→3’	Remplissage d’extrémité 3’→5’	Ajout d’une queue A pour le clonage	Phosphorylation de l’extrémité 5’
P7060L Klenow Fragment À venir	✔ Oui	✔ Oui	✘ Non	✘ Non
P7080L T4 DNA Polymerase*	✔ Oui	✔ Oui	✘ Non	✘ Non
P7010 Klenow (3’→5’ exo-)	✘ Non	✘ Non	✔ Oui	✘ Non
Y9040L T4 Polynucleotide Kinase	✘ Non	✘ Non	✘ Non	✔ Oui
Y9140† End Repair Mix	✔ Oui	✔ Oui	✘ Non	✔ Oui

Enzymes pour ligature d’ADN

Enzyme	Ligature
	Ligature d’extrémités cohésives	Ligature d’extrémités franches	Réparation des cassures
*L6090L E. coli* DNA Ligase** À venir	✔ Oui	✘ Non	✔ Oui
L6010L T3 DNA Ligase À venir	✔ Oui A/T > G/C [1,0 M NaCl]	✔ Oui	✔ Oui
L6030 T4 DNA Ligase À venir	✔ Oui	✔ Oui	✔ Oui
EN11 T4 DNA Ligase BLIRT	✔ Oui	✔ Oui	✔ Oui
L6020L T7 DNA Ligase À venir	✔ Oui	✘ Non	✔ Oui
EN13 Tth DNA Ligase*	✔ Oui	✘ Non	✔ Oui
L6060L Taq DNA Ligase^†À venir	✘ Non	✘ Non	✔ Oui

Clonage avec la technique SLIC

La technique SLIC exploite l’activité enzymatique exonucléase :

Clonage pour séquençage à haut débit (NGS)

Une banque destinée au séquençage à haut débit commence par un ADN fragmenté. L’action enzymatique complète les étapes du clonage.

icon-genomicsFragments à extrémité franche
Les extrémités sont franches et 5’ phosphorylées avec les enzymes ADN polymérase T4, fragment de Klenow et polynucléotide kinase (PNK) T4.
icon-bio-informaticsQueue A aux extrémités
Ensuite, on ajoute une queue A aux extrémités 3’ avec l’une de ces enzymes : Taq ADN polymérase ou fragment de Klenow (exonucléase 3’→5’).
icon-barcodeAjout d’adaptateurs
Puis des adaptateurs complémentaires ou des codes-barres sont ajoutés par ligature avec l’enzyme finale, l’ADN ligase T4.

Tous les composants enzymatiques nécessaires à la construction de la bibliothèque d’ADN peuvent être assemblés avec des adaptateurs dans un kit de préparation « maison ».

Synthèse des gènes

La synthèse des gènes est basée sur la liaison d’oligodésoxynucléotides qui présentent de longues régions de chevauchement complémentaire.

icon-temperatureTaq ADN ligase thermostable
Améliorez la synthèse en utilisant une Taq ADN ligase thermostable à la place d’une ADN ligase T4.

Plus les températures de ligature sont élevées, plus la probabilité d’obtenir des produits de ligature corrects est importante.
icon-targetLigase sélective selon les cassures

Utilisez une ligase sélective selon les cassures afin d’éviter les délétions dues à une ligature entre deux brèches.

Les ADN longs synthétisés ne sont pas liés dans n’importe quel ordre.

Découvrez nos enzymes destinées au clonage et à la recombinaison d’ADN

Questions fréquentes (FAQ) sur les enzymes pour le clonage et la recombinaison

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