Scientist analyzing dPCR results on dPCR system

PCR DIGITALE

Développement de dosage par dPCR et résolution de problèmes

Protocole de PCR digitale — Présentation

Le développement d’un dosage par PCR digitale (dPCR) dépend de plusieurs facteurs, notamment la matrice, l’instrument utilisé, les applications et les objectifs de l’expérience. La plupart des protocoles de PCR digitale comprennent une variation des étapes suivantes :

Préparation des échantillons — Dosage par dPCR

La préparation des échantillons est l’étape clé pour une PCR vraiment efficace. Il y a plusieurs paramètres importants à prendre en compte lors de la préparation de l’échantillon de départ en vue d’une PCR digitale.

Ces paramètres incluent :

Pureté de l’échantillon
Intégrité de la structure de l’échantillon
Longueur et séquence de l’échantillon
Quantité initiale de l’échantillon
Utilisation de réplicats
Utilisation de contrôles

L’optimisation de ces facteurs pour un cycle de dPCR plus efficace est abordée ci-après.

Pipetting as the first step of sample preparation in a dPCR protocol

Pureté de l’échantillon

La PCR est basée sur plusieurs réactions enzymatiques successives, elle est donc plus sensible aux impuretés, telles que les protéines, le phénol/chloroforme, les sels et l’EDTA, que les réactions catalysées par enzymes en une étape. La pureté des matrices d’acide nucléique est importante pour la dPCR, car les contaminants peuvent perturber la détection de la fluorescence.

Les alcools (éthanol, isopropanol) et les sels altèrent les propriétés de renaturation des amorces et des sondes et réduisent l’efficacité de l’amplification, p. ex. la fluorescence des fractions positives est réduite et la distinction entre les fractions positives et négatives est difficile
Les acides humiques perturbent la fluorescence des colorants de liaison à l’ADNdb, p. ex. EvaGreen
Les nucléases dégradent l’ARN et l’ADN
L’urée et le phénol dénaturent la Taq polymérase
Les polysaccharides acides imitent les acides nucléiques et forment des complexes fermés avec la Taq polymérase

Moins sensible que la qPCR aux effets inhibiteurs, la dPCR fonctionne de façon optimale avec des matrices d’une grande pureté. Il existe divers kits permettant d’obtenir une grande pureté d’acides nucléiques et une efficacité élevée de la PCR en fonction de la matrice, comme l’ADN génomique, l’ADN plasmidique, l’ARN total, etc.

Intégrité de l’échantillon : longueur et séquence

La longueur et la séquence des amplicons ont autant d’influence que la pureté de la matrice sur la réussite d’une expérience de dPCR. L’ARN et l’ADN matriciels fortement dégradés affichent généralement une différence entre la quantité d’ADN quantifié par DO et le nombre de copies amplifiées et détectées par la dPCR. Une quantité d’ADN plus importante que prévu pourrait être nécessaire pour obtenir la sensibilité souhaitée (p. ex. pour la détection des mutations). Il est conseillé d’avoir des amplicons le plus court possible, surtout si vous utilisez des échantillons fortement dégradés (ADN FFPE, ADNlc).

De même, les nœuds de réticulation résiduels peuvent empêcher la séparation des brins et l’amplification, et des sites abasiques peuvent induire une amplification non spécifique. Des kits et protocoles dédiés sont à votre disposition pour la récupération d’ADNg de haute qualité à partir d’échantillons FFPE.

Intégrité de l’échantillon : structure

Le fractionnement aléatoire de la matrice est primordial pour une quantification de précision avec un protocole de dPCR. Une répartition uniforme du signal de PCR est observée pour la plupart des ADN matriciels, notamment l’ADN fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE), l’ADN libre circulant (ADNlc), l’ADN complémentaire (ADNc) et les gBlocks.

Pour obtenir une répartition uniforme des matrices de poids moléculaire élevé ayant des structures complexes, il est recommandé d’appliquer des stratégies comme la digestion par enzymes de restriction.

Il est recommandé de recourir à la digestion par enzymes de restriction avant le dosage par PCR digitale dans l’un quelconque des cas suivants :

Solutions hautement visqueuses – Une viscosité élevée peut diminuer la précision de la mesure, surtout si vous utilisez des quantités importantes d’ADN en volumes moindres. En utilisant la digestion par enzymes de restriction pour réduire la viscosité, vous pouvez utiliser des concentrations d’ADN bien supérieures (1 µg) dans le protocole de dPCR.
Copies de gènes liées ou en tandem – Si une fraction positive contient plusieurs copies, les copies liées sont considérées comme une seule copie. La digestion par enzymes de restriction peut résoudre ce problème en séparant physiquement les copies de gènes afin de les isoler indépendamment dans les fractions.
Plasmides superenroulés – La digestion par enzymes de restriction est recommandée pour linéariser l’ADN plasmidique et améliorer l’accessibilité et l’efficacité de la liaison de l’amorce/la sonde à l’ADN. Cela accroît la précision de la quantification des plasmides.
Grandes molécules d’ADN (> 30 kb) – Les grandes molécules d’ADN peuvent être fractionnées de façon non homogène, ce qui entraîne une quantification excessive de la concentration de la matrice. La digestion par enzymes de restriction permet de fragmenter les grandes matrices en éléments plus petits, donnant ainsi une répartition homogène et une quantification plus précise.

Rappel

Lorsque vous optez pour les enzymes de restriction, l’enzyme ne doit pas couper la séquence même d’amplicons.

Quantité initiale de l’échantillon

La quantité initiale de l’échantillon dépend de la technologie de dPCR utilisée. Dans la PCR digitale sur nanoplaques QIAcuity, vous pouvez utiliser jusqu’à 217 000 copies par réaction sur les nanoplaques 26k et jusqu’à 170 000 copies sur les nanoplaques 8,5k.

Calculer le nombre de copies

Si la taille du génome haploïde d’un organisme est connue, la corrélation entre la grande quantité d’ADN génomique (ADNg) et le nombre de copies obtenu (pour un gène à copie unique) peut être calculée avec la formule suivante :

Taille du génome (pb) × poids moyen d’une seule paire de bases (1,096 × 10^–21 g/pb)

À titre d’exemple, pour le génome humain d’une taille approximative de 3,3 × 10⁹ pb, le calcul est le suivant :

3,3 × 10⁹ pb × 1,096 × 10⁻²¹ g/pb = 3,3 × 10⁻¹² g = 3,3 pg

Le tableau ci-dessous indique le nombre de copies à partir de 10 ng d’ADNg de divers organismes

Rappel

En dPCR, le nombre moyen de copies/fractions ne doit pas dépasser 5. Idéalement, il doit être compris entre 0,5 et 3.

Réplicats

Il est recommandé d’analyser les échantillons en double ou en triple afin d’éviter un biais dans la quantification imputable à des erreurs de pipetage. L’ajout des données de l’ensemble des répétitions augmente le nombre d’événements mesurés. Cela accroît la précision du dosage par PCR digitale.

Contrôles

Contrôles négatifs – nécessaires pour surveiller les réactions en faux positif, pouvant survenir à cause d’une contamination ou de problèmes d’amorces et de sondes. Les contrôles négatifs sont également utilisés pour déterminer la limite de détection (LOD).
Contrôles positifs – utilisés pour tester si l’amplification de la matrice se produit dans les conditions définies pour la réaction
Contrôles sans matrice (NTC) – permettent de contrôler la contamination dans l’ensemble des réactifs

La PCR digitale sur le système QIAcuity : présentation

Ce webinaire aborde les divers aspects fondamentaux de la PCR digitale sur les instruments QIAcuity, tout particulièrement la sélection des matrices et leurs concentrations.

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Procédés chimiques de détection

Colorants de liaison à l’ADN

Les colorants intercalants fluorescents pour ADN, de type EvaGreen, se lient à toutes les molécules d’ADN double brin et émettent au moment de la liaison un signal fluorescent d’une longueur d’onde définie. L’intensité du signal augmente avec le nombre de cycles en raison de l’accumulation du produit de PCR. Avec des colorants de liaison à l’ADN de type EvaGreen, vous pouvez analyser de nombreuses cibles différentes, mais sans devoir synthétiser les sondes marquées spécifiques à la cible. Toutefois, les produits de PCR et les dimères d’amorces non spécifiques peuvent contribuer au signal fluorescent et même passer pour un groupe distinct de signaux fluorescents lors de l’analyse des données de PCR digitale. Une spécificité de PCR élevée est indispensable si vous utilisez le colorant EvaGreen.

Fluorescence detection using DNA intercalating dyes in digital PCR

Fluorescence detection using primers/probes in digital PCR

Sondes d’hydrolyse

Les sondes d’hydrolyse, appelées sondes TaqMan, sont des oligonucléotides spécifiques à la séquence présentant un fragment de fluorophore et de quencher lié. Un fluorophore se lie à l’extrémité 5' de la sonde et un quencher se lie à son extrémité 3' ou à l’intérieur de la séquence d’intérêt. Lors de la phase d’extension de la PCR, la sonde est clivée par l’activité exonucléase 5′→3′ de la Taq ADN polymérase, ce qui sépare le fragment de fluorophore et de quencher. Ainsi, il est possible de détecter un signal de fluorescence proportionnel à la quantité de produit de PCR accumulée.

Petit conseil pour éviter les problèmes avec la dPCR : évitez certaines combinaisons de rapporteur et de quencher. Par exemple, si l’émission du quencher chevauche celle du colorant fluorescent, cela génère des signaux de fond supplémentaires dans le canal de fluorescence correspondant. Ce bruit de fond compromet la séparation des groupes et la résolution de pointe.

Concevoir des amorces et des sondes

Une conception efficace des amorces et des sondes est essentielle pour réussir les dosages par PCR digitale. La conception des amorces et des sondes dans un protocole de dPCR respecte les mêmes règles que pour les dosages par qPCR. Les points importants de cette conception sont :

Concordance des cibles
Composition des bases
Longueur des amplicons
Température de fusion
Absence de structures secondaires
Absence d’auto- et d’inter-complémentarité (auto-renaturation)
Absence de réactivité croisée

Optimizing primer design and probe design for digital PCR assays

L’une des différences dans la conception des amorces et des sondes pour un protocole de PCR digitale est que les concentrations des amorces et des sondes tendent à être plus élevées en dPCR qu’en qPCR. Les concentrations supérieures des amorces et des sondes accroissent l’intensité/amplitude de la fluorescence, cela permet de mieux distinguer le bruit de fond des signaux spécifiques. Et puis vous pouvez obtenir une quantification de cibles plus précise. Des données probantes indiquent que pour des résultats optimaux, la concentration finale des amorces doit être définie entre 0,5 µM et 0,9 µM et celle des sondes à 0,25 µM par réaction.

Conservation des amorces et des sondes

En plus de soigner la conception du dosage et d’utiliser des concentrations d’amorces et de sondes appropriées, il est indispensable de conserver correctement les amorces et les sondes pour une dPCR réussie.

Les amorces et sondes lyophilisées doivent être dissoutes dans un petit volume de tampon à faible teneur en sel, comme un tampon TE de 100 µM (Tris Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), pour obtenir une solution de conservation. En revanche, les sondes marquées aux colorants fluorescents Cy5 et Cy5.5 doivent être conservées dans un tampon TE, pH 7,0, car elles ont tendance à se dégrader avec un pH plus élevé.

Pour conserver les amorces, vous pouvez conserver de petites aliquotes dans un tampon TE sans nucléase, à -20 °C pendant au moins 1 an. Les sondes marquées à des colorants fluorescents sont stables dans ces mêmes conditions pendant 6 à 9 mois. Évitez les multiples cycles de congélation/décongélation pour écarter tout risque de dégradation.

Pour les ensembles d’amorces-sondes utilisés dans les dosages par dPCR multiplex, vous pouvez utiliser des mélanges d’amorces-sondes × 20, avec 2 amorces et 1 sonde pour une cible particulière aux concentrations suggérées.

Pour reconstituer les amorces et les sondes, vous devez centrifuger délicatement un tube contenant une amorce ou une sonde lyophilisée afin de recueillir tout le matériel au fond du tube. Pour la dissolution complète de l’amorce ou de la sonde, vous devez ajouter, mélanger puis laisser reposer 20 minutes le volume requis de tampon TE stérile sans nucléase. La solution d’amorce ou de sonde doit être de nouveau mélangée et la concentration déterminée par spectrophotométrie. Petit conseil pour éviter les problèmes avec la dPCR : évitez de dissoudre les amorces et les sondes dans l’eau. Certaines de ces amorces et sondes présentent une solubilité et une stabilité dans l’eau inférieures à celles qu’elles ont dans le tampon TE.

Réalisation d’un cycle de dPCR

A representation of the nanoplate dPCR workflow

Il existe trois étapes principales à la réaction dans une procédure de dPCR sur nanoplaques standard : chargement de l’échantillon, amplification et analyse des données.

Pour optimiser les étapes de la réaction de dPCR, vous pouvez appliquer directement à la dPCR les conditions de la qPCR qui donnent des résultats de qualité. Néanmoins, il convient de vérifier systématiquement les recommandations du fabricant quant aux exigences spécifiques.

Conseils pour le chargement de l’échantillon

La première des trois étapes de la réaction de dPCR consiste à préparer et charger l’échantillon. Pendant la préparation du mélange pour PCR et le chargement de la nanoplaque, tenez compte des recommandations suivantes :

Décontaminez votre espace de travail et votre matériel de laboratoire afin de limiter le risque de contamination par un ADN extérieur
Pour garantir l’efficacité maximale de la PCR, testez l’échantillon avec différentes dilutions avant le dosage par PCR digitale principal
Décongelez parfaitement l’ensemble des composants avant de préparer les mélanges réactionnels, mélangez-les bien jusqu’à obtenir des solutions homogènes puis centrifugez-les brièvement pour éviter tout débordement.
Mélangez le Master Mix avec l’échantillon, les amorces, l’eau sans RNase et les enzymes de restriction, si vous en utilisez
Utilisez des pointes de pipette stériles
Pipettez le mélange réactionnel dans la nanoplaque. Veillez à ne pas introduire de bulles dans les puits de la nanoplaque de dPCR pendant le transfert de l’échantillon et le transport de la plaque
Pour éviter une évaporation et une contamination, scellez bien la nanoplaque avec un film
Placez la nanoplaque dans l’instrument de dPCR en la tenant uniquement par les côtés, ne la secouez ni ne la retournez pas, le mélange réactionnel de dPCR doit rester au fond des puits
Configurez le logiciel puis démarrez le cycle de dPCR

Conseils pour l’amplification

La deuxième des trois étapes de la réaction de dPCR consiste à appliquer le protocole de dPCR pour l’amplification. Au cours de cette étape, le mélange réactionnel de chaque puits est fractionné en plusieurs milliers de réactions individuelles. Ensuite un thermocycleur exécute la réaction de PCR. Si une fraction contient un matériel matriciel, un signal de fluorescence positif est détecté au cours de l’imagerie. Les images sont ensuite traitées par le logiciel dédié. Vous pouvez surveiller le statut actuel de la plaque, directement sur l’instrument de dPCR ou à l’aide de la suite logicielle connectée.

Conseils pour des conditions d’amplification optimales et une PCR efficace :

Température de renaturation – elle peut avoir une incidence sur la spécificité du dosage par dPCR. Généralement définie entre 55 °C et 65 °C, la température de renaturation optimale est atteinte lorsque l’écart entre les fractions positives et négatives est maximal. L’augmentation de cette température peut accroître l’écart entre les signaux positifs et le bruit de fond.
Cycles d’amplification – il est recommandé de lancer jusqu’à 40 cycles d’amplification pour obtenir un écart suffisant entre les signaux positifs et le bruit de fond. Dans certains cas, le nombre de cycles thermiques pourra devoir être augmenté afin d'atteindre une performance optimale.

Analyse des données de PCR digitale

Dans la dernière des trois étapes de la réaction de dPCR, les données de PCR digitale sont analysées avec une quantification absolue d’après la loi de Poisson.

La QIAcuity Software Suite peut réaliser une analyse des données de PCR digitale en fonction de l’application visée : quantification absolue, détection des mutations, édition génomique, variation du nombre de copies ou expression génique. Dans l’analyse de quantification absolue (analyse de premier niveau), le logiciel génère un schéma de concentration et une vue des fractions positives et négatives pour certains puits. Une vue avec carte de densité indique le canal cible et le canal de référence. Vous pouvez utiliser les histogrammes et les diagrammes de dispersion pour modifier les paramètres de seuil et recalculer les résultats. Dans la QIAcuity Software Suite, vous pouvez générer des rapports contenant les résultats d’analyse de votre plaque. La quantification absolue est indispensable pour tous les calculs ultérieurs et les analyses de deuxième niveau (à savoir détection des mutations, expression génique, variation du nombre de copies, etc.).

Conseils pour l’analyse des données de PCR digitale :

Définissez un seuil pour la classification des fractions en positives ou négatives juste au-dessus du groupe de fractions négatives
Utilisez l’échantillon NTC, avec uniquement des fractions négatives, pour mieux définir le seuil puis procédez à une inspection de tous les puits
Vous pouvez définir l’amplitude de fluorescence de chaque puits légèrement au-dessus ou au-dessous des NTC, pour éviter une classification incorrecte de certaines fractions
Bien qu’il n’existe pas de valeur communément admise, une réaction est généralement considérée comme positive si le nombre de fractions positives dépasse 2
Face à la variabilité d’un puits à l’autre et d’un lot à l’autre, utilisez le facteur de précision du volume (VPF) pour définir le volume exact de chaque puits puis appliquez ce facteur aux calculs de concentration effectués par le logiciel

Exemples de données de PCR digitale

Guide des applications de PCR digitale QIAcuity

Trouvez des informations pertinentes sur la préparation des expériences et l’analyse des données pour les applications de dPCR.

Obtenir le guide

Directives MIQE au format numérique (dMIQE)

Les directives dMIQE (Minimum Information for Publication of Digital PCR Experiments – Informations minimales pour la publication des expériences de PCR digitale), créées à l’origine pour garantir la reproductibilité et la comparabilité des résultats de qPCR, ont été adaptées au protocole de PCR digitale. Ces directives permettent de produire et publier des données de dPCR, dans l’optique d’harmoniser l’approche de dPCR et de fournir des résultats pertinents, pouvant être rapidement interprétés par différents laboratoires.

Les directives dMIQE contiennent une liste de vérification relative à la publication de résultats de dPCR, de sorte que les méthodes et les résultats puissent être reproduits, suivis et compris. Les directives dMIQE facilitent la réplication des expériences et fournissent des informations primordiales pour l’analyse et la vérification de la qualité technique des travaux, quelle que soit la technologie de dPCR utilisée.

Researchers optimizing dPCR assays and remaining compliant with dMIQE guidelines

Les éléments de la liste de vérification des directives dMIQE sont considérés comme fondamentaux pour publier des résultats de dPCR. Les informations qui doivent être indiquées sont entre autres :

Nombre moyen de copies de cibles d’ADN par fraction (λ)
Nombre de fractions utilisées (associé au nombre moyen de copies de cibles d’ADN, les valeurs peuvent déterminer la précision du dosage par dPCR)
Informations sur la structure de la matrice, car la nature de l’échantillon peut avoir une incidence sur la précision et la fiabilité des données :
- Type de matrice dans chaque fraction : génomique, plasmidique, etc.
- Source : organisme, tissu, cellule, aliment, plante, etc.
- Traitement : digestion par enzymes de restriction, ultrasons, préamplification, dilution, aucun
Volume dans chaque fraction, ce volume pouvant varier d’une plate-forme de dPCR à une autre
Volume total de la réaction, qui peut être calculé en multipliant le nombre de fractions par le volume d’une fraction
Types de contrôles utilisés
Graphiques d’amplification ou valeurs de fluorescence en point final représentatifs des données expérimentales positives et négatives
Exemple de variance empirique, de préférence à partir de plusieurs réplicats biologiques pour illustrer plus précisément l’incertitude expérimentale
Autres

Livre blanc : comprendre et gérer le volume mort

Le volume mort est un paramètre important dans les directives dMIQE. Découvrez comment dépasser les limites imposées par le volume mort afin d’obtenir une sensibilité supérieure de la dPCR.

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Transférer et optimiser les dosages de la qPCR à la dPCR

Les points à prendre en compte pour la conception de dosages par real-time PCR s’appliquent également à un protocole de PCR digitale. Un dosage qui donne des résultats satisfaisants en qPCR sera tout aussi réussi en dPCR. Il est conseillé d’utiliser d’abord les concentrations issues d’une méthode de qPCR validée, puis d’appliquer un gradient de concentration d’amorce/de sonde si les valeurs de fluorescence en point final des fractions positives doivent être améliorées. Comme indiqué dans les sections précédentes, vous devez également vérifier la compatibilité des fluorophores, les conditions recommandées pour le thermocyclage et les concentrations d’amorce/de sonde pour la dPCR.

Paramètres d’optimisation du dosage par dPCR

Quoi qu’il en soit, avant de démarrer un nouveau dosage, un test d’essai initial est toujours recommandé pour évaluer les performances. Il est également conseillé d’utiliser des contrôles représentatifs et correctement caractérisés dans une matrice de fond adaptée. Le dosage doit être optimisé pour garantir la précision analytique si les performances ne sont pas optimales. En pareil cas, il est indispensable de fournir les détails du processus d’optimisation à des fins de reproductibilité.

Pour l’optimisation rapide de dosages non optimaux, en appliquant un gradient de température au cours des étapes de renaturation, vous pouvez utiliser les Master Mix QIAcuity sur n’importe quel instrument de real-time PCR.

Livre blanc : précision et sensibilité de la qPCR vs la dPCR

Explorez les données comparant les performances de la qPCR et de la dPCR pour prendre une décision éclairée et adapter la méthode à votre application.

Résolution de problèmes avec la PCR digitale

Les expériences de dPCR peuvent être affectées par les mêmes problèmes que la qPCR ou la PCR classique. Toutefois, certains problèmes spécifiques au dosage par PCR digitale peuvent se poser. Le tableau constitue un guide de résolution de problèmes pour la dPCR face aux problèmes couramment rencontrés avec un protocole de dPCR. Les causes possibles et les recommandations des experts y sont présentées.

Plus de support technique pour l’optimisation de la dPCR

Références

Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (accessed January 20, 2023)

Lindner L et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies. Methods. 2021; 191(4):95-106.

Pecoraro S et al. Overview and recommendations for the application of digital PCR. EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019

QIAGEN. QIAcuity User Manual Extension. June 2021.

Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012; 113(5):1014-1026.

Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020; 412:2009-2023.

The dMIQE Group and Hugget JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. 2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.