Flux de travail et produits de PCR digitale

Vous pouvez consulter notre Guide d’application QIAcuity pour des consignes détaillées et des tutoriels pas à pas relatifs à la configuration des expériences de PCR numérique. Nous vous encourageons également à consulter les directives MIQE en version numérique et leur mise à jour (Huggett JF et al, 2013 et 2020) pour des éléments supplémentaires sur la configuration et l’émission des résultats d’expériences de PCR numérique.

Le QIAcuity lit la fluorescence émise par le fond de la plaque, qui est recouverte d’une feuille. Pour des résultats optimaux, faites en sorte que la feuille reste propre et veillez à ne pas l’endommager (éraflures, etc.). Le code-barres sur le côté de la plaque doit aussi rester propre et intact. Veillez à porter des gants en manipulant la plaque et n’exercez aucune force dessus. Pour manipuler la plaque en toute sécurité, mettez-la dans un plateau pour nanoplaques.

Le logiciel de votre système de dPCR vous permettra d’effectuer des analyses de premier et deuxième niveaux. L’analyse de premier niveau peut inclure un schéma de concentration, un aperçu des fractions dans les puits d’intérêt ou une carte de densité permettant de comparer le canal cible au canal de référence. Vous pouvez utiliser les histogrammes et les diagrammes de dispersion pour modifier les paramètres de seuil. L’analyse de deuxième niveau vous permet d’analyser les données de PCR en fonction des objectifs de l’application (détection des mutations, analyse de l’expression génique, etc.).

La création d’amorces pour la PCR digitale est semblable à la création d’amorces pour la qPCR. Vous devez porter une attention particulière à la concordance des cibles, la composition des bases, la longueur des amplicons, la température de fusion, les structures secondaires, l’auto-complémentarité et l’inter-complémentarité (auto-renaturation) et la réactivité croisée. L’une des différences est que les amorces pour la dPCR sont souvent utilisées à des concentrations supérieures à celles de la qPCR afin de mieux distinguer les signaux spécifiques du bruit de fond.

Dans la grande majorité des applications de dPCR QIAcuity, l’ADN matriciel est uniformément réparti dans les chambres de réaction de la QIAcuity Nanoplate. Dans les réactions QIAcuity utilisant comme modèles des produits de PCR ou de l’ADN hautement fragmenté (ADN FFPE, ADN libre circulant), de l’ADN complémentaire (ADNc), des gBlocks, etc., on observe une répartition uniforme du signal PCR. Toutefois, les molécules d’ADN > 20 kb ou les plasmides ne sont pas fractionnés de façon uniforme, ce qui entraîne une quantification excessive de la concentration de la matrice. En ajoutant des enzymes de restriction directement dans les mélanges réactionnels QIAcuity, il est possible de fragmenter les matrices de grande taille en éléments plus petits, cela donne une répartition homogène de la matrice et une quantification de précision. C’est particulièrement important pour les analyses de variation du nombre de copies (VNC), dans lesquelles plusieurs copies d’un gène peuvent être liées en tandem. En ajoutant des enzymes de restriction aux mélanges réactionnels, les utilisateurs doivent s’assurer que les enzymes ne coupent pas la séquence d’amplicons. Il est recommandé d’ajouter les enzymes de restriction au Master Mix puis d’incuber 10 minutes à température ambiante après l’ajout de la matrice.

L’instrument de dPCR QIAcuity est capable de détecter les colorants tels que FAM, EvaGreen, VIC, HEX, TAMRA, ROX et Cy5. 

Tous les échantillons d’ADN utilisés dans les mélanges réactionnels doivent présenter une qualité et une quantité similaires, ce qui peut être aisément évalué par spectrophotométrie ultraviolet (UV). Les échantillons d’ADN d’une longueur moyenne ≥ 20 kb (par exemple, ADN génomique purifié par colonne de centrifugation avec membrane de silice) doivent être fragmentés par digestion par enzymes de restriction avant le fractionnement. La fragmentation enzymatique d’échantillons d’ADN de grande taille assure une répartition homogène de la matrice sur la QIAcuity Nanoplate, ce qui permet une quantification d’une précision rigoureuse.