therascreen KRAS Pyro Kit

Pour la détection et la quantification de mutations du gène KRAS par séquençage

Caractéristiques

Conforme à la directive européenne IVD 98/79/CE
Résultats complets en temps-réel
Quantification précise de mutations du gène KRAS
Interprétation aisée des informations de séquences complexes

Détails produit

Le kit therascreen KRAS Pyro est un kit de détection moléculaire destiné à l’identification de mutations et délétions du gène KRAS. Ce kit inclut les amorces et les réactifs pour l’amplification du gène KRAS, ainsi que les tampons, amorces et réactifs pour la détection et la quantification des mutations en temps-réel via la technologie de pyroséquençage (Pyrosequencing) sur le système PyroMark Q24. (1)

Performances

Linéarité

La linéarité a été mesurée conformément à la norme EP6-A du CLSI « Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: a statistical approach; approved guideline ». Les plasmides porteurs de séquences sauvages et mutantes ont été mélangés proportionnellement pour donner les niveaux de mutation suivants : 0 ; 12,5 ; 25 ; 37,5 et 50 %. Quatre réplicats de ces mélanges ont été placés au hasard sur une plaque et analysés. Les résultats pour la mutation GGT->TGT au niveau du codon 12 sont indiqués (figure « Linéarité de la mutation GGT->TGT »). (1)

Précision <br>

La détermination de la linéarité de la mutation GGT->TGT au niveau du codon 12 a été répétée par 3 opérateurs sur 3 jours différents avec diverses combinaisons d’instruments et de réactifs PyroMark Q24.

Les valeurs de précision intermédiaire (écart-type) sont comprises entre 0,6 et 2,0 unités % pour la limite mesurée du niveau de mutation entre 0 et 50 %.

Précision moyenne
% de plasmides mutés	Analyse n° 1 (Moyenne ; É.T.)	Analyse n° 2 (Moyenne ; É.T.)	Analyse n° 3 (Moyenne ; É.T.)	Résumé (Moyenne ; É.T.)
0,0	0,6 ; 0,2	1,7 ; 0,7	0,7 ; 0,2	1,0 ; 0,6
12,5	13,3 ; 1,5	16,2 ; 1,9	14,6 ; 3,0	14,7 ; 1,4
25,0	23,8 ; 1,4	26,8 ; 2,4	26,9 ; 2,9	25,8 ; 1,8
37,5	42,0 ; 1,9	41,7 ; 0,5	38,5 ; 2,6	40,7 ; 2,0
50,0	49,7 ; 2,4	50,5 ; 1,8	49,1 ; 4,8	49,8 ; 0,7

Principe

Le kit therascreen KRAS Pyro est utilisé pour les mesures quantitatives de mutations des codons 12, 13 et 61 du gène KRAS humain en temps réel, à l’aide de la technologie de pyroséquençage sur le système PyroMark Q24. Le gène KRAS encode une protéine qui joue un rôle essentiel dans la cascade de signaux EGFR. Les mutations du gène KRAS peuvent affecter la manière dont les protéines stimulent ces voies en aval. Le gène KRAS est muté dans près de 30 % de l’ensemble des types de cancer. Parmi les cancers qui présentent une haute fréquence de la mutation du gène KRAS se trouvent le cancer colorectal (35 %) et le cancer du poumon (18 %). (1)

Les mutations suivantes sont détectées :

Codon 12/13 : G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D
Codon 61 : Q61E, Q61H, Q61L, Q61R

Procédure

Le produit contient 2 tests : le premier pour la détection des mutations au niveau des codons 12 et 13 et le second pour la détection des mutations au niveau du codon 61 (voir figures « Illustration du test KRAS » et « Tracé de pyrogramme d’un génotype normal au niveau des codons 12 et 13 »). Les deux régions sont amplifiées séparément par PCR et séquencées dans la région définie. Les séquences entourant les positions définies servent de valeurs maximales de normalisation et de référence pour l’évaluation quantitative et qualitative de l’analyse. (1)

Après l’utilisation des amorces PCR ciblant les codons 12/13 et le codon 61, les amplicons sont immobilisés sur des billes de sépharose recouvertes de streptavidine (Streptavidin Sepharose High Performance). L’ADN simple brin est préparé et les amorces de séquence correspondantes s’hybrident avec l’ADN. Les échantillons sont ensuite analysés sur le système PyroMark Q24 à l’aide d’un fichier de configuration d’analyse et d’un fichier d’analyse. Le KRAS Plug-In Report doit être utilisé pour analyser le test. Ce rapport permet de s’assurer que les valeurs de limite de détection (LoD) correctes sont utilisées et que les différentes séquences à analyser sont automatiquement utilisées pour la détection de toutes les mutations. Toutefois, le test peut également être analysé à l’aide de l’outil d’analyse intégré au système PyroMark Q24 (voir figure « Tracé de pyrogramme présentant une mutation de GGT->GAT au niveau de la base 2 du codon 12 »). La fonction « Sequence to Analyze » (séquence à analyser) peut être ajustée afin de détecter les mutations rares après l’analyse (voir figures « Tracé de pyrogramme de la mutation de GGT->TGT dans la base 1 du codon 12 » et « Tracé de pyrogramme présentant la réanalyse de l’échantillon dans la figure précédente »). (1)

Applications

Le kit therascreen KRAS Pyro permet de procéder à la détection quantitative des mutations au niveau des codons 12, 13 et 61 du gène KRAS humain. Ce kit a été conçu pour faciliter l’identification des patients atteints de cancer colorectal les plus à même de bénéficier de thérapies anti-EGFR. (1)

Les mutations suivantes sont détectées :

Codon 12/13 : G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D
Codon 61 : Q61E, Q61H, Q61L, Q61R

Données et illustrations utiles

Pyrogram trace of a normal genotype in codons 12 and 13.

Pyrogram trace of a GGT to TGT mutation in base 1 of codon 12.

Pyrogram trace of a GGT to GAT mutation in base 2 of codon 12.

Pyrogram trace of the reanalysis of the sample in the previous figure.

Ressources

FAQ

Reconstiuted enzyme and substrate of PyroMark Gold Reagents, should not be vortexed since this could lead to conformational changes which affect the activity.

FAQ ID -2844