En primer lugar, el ADN del inserto y el vector se digiere mediante endonucleasas de restricción para crear fragmentos de ADN con extremos salientes (o romos). A continuación, los fragmentos de ADN deseados se aíslan y se unen posteriormente mediante tratamiento con ADN ligasa. Por último, el vector intacto resultante se transforma en células E. coli competentes, y los transformantes se identifican mediante métodos de selección genética adecuados.

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