EpiTect MethyLight PCR Kits

• 高精度なTaqManプローブ法によるリアルタイム解析
• MethyLight Assayを用いて確実なメチル化定量
• 簡便なマスターミックスフォーマット

EpiTect MethyLight PCR Kit およびEpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kitは、TaqManプローブあるいはダブル標識プローブによりメチル化部位を判別し、高感度で信頼できる定量を実現します。キットは即使用可能で、至適化は必要ありません。本キットは様々なリアルタイムサイクラー上で使用できます。EpiTect MethyLight PCR KitはApplied Biosystems 7500 を除く全てのApplied Biosystems 社製のサイクラーに適しています。EpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kit は、AppliedBiosystems 7500、Bio-Rad、Cepheid、Corbett、Eppendorf、Roche、Stratagene製装置を含むほとんどのサイクラーに対応しています。

EpiTect MethyLight PCR Kitsは、EpiTect MethyLight Assaysや他のダブル標識アッセイと組み合わせて使用でき、Bisulfite処理したDNAの高感度定量が可能です。配列判別のレベルに応じて、MethyLight解析は定量あるいはセミ定量フォーマットで行なわれます。 

TaqManプローブなどのダブル標識プローブは、蛍光団およびクエンチャーを有する配列特異的なオリゴヌクレオチドです。蛍光団はプローブの5'末端に、クエンチャーは内部または3'末端に付加されています。PCRのエクステンション中に、ポリメラーゼの 5'→3' エキソヌクレアーゼ 活性によりプローブは分解され、蛍光団はクエンチャー色素から分離します。この結果PCR 産物の蓄積量に比例した蛍光シグナルが検出されます。

メチル化特異的プローブを用いたQuantitative MethyLight リアルタイムPCR

MethyLight PCRを用いた定量的メチル化解析では、異なる蛍光標識の2つのダブル標識プローブをPCRプライマーセットと組み合わせて使用します。Bisulfite処理したDNAでは、メチル化CpG部位および非メチル化CpG部位に対して異なるプローブ配列が必要です。プライマーは非メチル化部位に特異的なものです。このプローブの一方は目的の部位のメチル化DNAに特異的に結合し、もう一方は同部位の非メチル化DNAに特異的に結合します。プローブは異なる蛍光団を含んでいるので、メチル化配列と非メチル化配列の量を測定できます（図 " MethyLight リアルタイム定量PCR"）。

メチル化特異的プライマーを用いたSemiquantitative MethyLight リアルタイムPCR

MethyLight PCRを用いたセミ定量的メチル化解析では、ダブル標識プローブを目的のメチル化部位に特異的に結合するPCRプライマーセットと組み合わせて使用します。Bisulfite処理したDNAでは、メチル化CpG部位および非メチル化CpG部位に対して異なるプローブ配列が必要であり、このプライマーはBisulfite処理したDNAのメチル化部位に特異的な配列になっています。 メチル化特異的なプライマーがDNAに結合すると伸長し、Taq DNA Polymeraseの 5'→3' エキソヌクレアーゼ活性がプライマーを分解し、蛍光団を放出します。蛍光団がクエンチャーから切り離される際に蛍光が検出可能になります（図 " MethyLight リアルタイムセミ定量PCR"）。

特異性の増加

EpiTect MethyLight Master Mixは、配列特異的なプローブを用いたメチル化および非メチル化DNAの高感度検出用に特別に開発されました。PCRバッファーには様々な塩類や添加物に加えて、特別に最適化された割合でKClと(NH4)₂SO₄を含んでいるため、各PCRサイクルのアニーリングステップでの非特異的なプライマーとプローブの結合に対し、特異的な結合の比率を増大します。これによりプローブの選択的なハイブリダイゼーションが形成され、非メチル化／メチル化のターゲット配列を検出することができます。厳密なプライマーアニーリング条件によりBisulfite変換DNAを増幅する際のPCR特異性が増大し、プローブ法によるメチル化検出の信頼性が増します。

MethyLight PCRのコントロール反応

MethyLight PCR プローブおよびプライマーがメチル化DNAおよび非メチル化DNAに特異的に結合しているかを確認するためには、コントロール反応を行なわねばなりません。そのような反応の際には、種々の濃度のbisulfite変換コントロールDNA（完全にメチル化されているDNAと完全な非メチル化DNA）が必要となります。さらにこれらのControl DNAのミックスが、メチル化率を定量する際のスタンダードとなります。QIAGENのEpiTect Control DNA Setは、コントロール反応に必要な品質管理されたDNA — bisulfite変換メチル化DNA、bisulfite変換非メチル化DNA、正常ヒトゲノムDNA — が含まれており、信頼性の高い標準的なメチル化特異的コントロール反応に直ちに使用できるキットフォーマットです。

EpiTect MethyLight PCR Kitは迅速かつ簡便に反応セットアップができるマスターミックスフォーマットを採用しています。マスターミックスにROX含有のキットと含有されていないキットの2種類があり、様々なリアルタイムサイクラーで使用可能です。プロトコールはほとんどのリアルタイムサイクラーで最適な結果が得られることが検証済みです。

EpiTect MethyLight PCR Kitには、ROX passive reference dye含有マスターミックスが添付されており、蛍光補正のために高濃度のROX色素を必要とするリアルタイムサイクラーでの使用に適しています（例、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systemsを除くApplied Biosystems製の機器）。

EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial KitのマスターミックスにはROX色素は含まれていませんが、別個にROX溶液が添付されており、使用するリアルタイムサイクラーにより反応に加えることができます。このキットは、蛍光補正に低濃度のROX色素を必要とするサイクラー（例、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems）、オプションでROX色素を使用するサイクラー（例、Stratagene製の機器）、およびROX dyeを必要としないサイクラーに向いています。

エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー

エピジェネティクス情報を得ることは生物学や医学研究における多くの分野（特に、腫瘍学や幹細胞研究、および発生生物学）にとって最も重要です。しかし、DNA メチル化における変化の解析は、サンプル（特に非常に限られた量のサンプル）から再現性のあるデータを得るための標準化された方法がないために非常に困難です。QIAGENが新しく紹介するEpiTectソリューションにより、DNAサンプル採取、安定化、精製からBisulfite処理、リアルタイムPCRやエンドポイントPCR、メチル化解析、シークエンシングまで、標準化されたプレアナリティカル用製品および解析用製品を提供致します。（図 " エピジェネティクスにおける標準化されたワークフロー"）。

EpiTect MethyLight PCR Kit は定量およびセミ定量のリアルタイムPCR解析に最適で、EpiTect MethyLight Assayやその他の2種類の標識プローブを利用したアッセイと組み合わせて使用できます。