PCR & DNA増幅

Taq DNAポリメラーゼ（Taq）は、細菌のDNA修復やほとんどのバクテリオファージのDNA複製に関連する酵素のグループであるポリメラーゼFamilyAに属します。FamilyAポリメラーゼは一般に、複製と修復の両方の活性を備えています。3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は、ミスマッチヌクレオチドの修復を可能にする重要な“プルーフリーディング”機能を提供し、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、RNAプライマーの除去を可能にします。Taqポリメラーゼでは、3’→5’エキソヌクレアーゼのプルーフリーディングドメインが機能していません。

PCRでは、細胞の複製系で必要とされるのと同じように、ポリメラーゼの信頼性、正確性、フィデリティ、速度、処理能力といった基本的な性能が問われます。ポリメラーゼの正確さ（フィデリティ）とは、テンプレート鎖が指定したとおりに正しいヌクレオチドを取り込むことを指します。DNAポリメラーゼは、ヌクレオチドが取り込まれる部位にある一連の分子チェックポイントを利用して、正確な複製を保証します。通常のTaqポリメラーゼは、総エラー率が比較的に低く非常に正確ですが、3’→5’エキソヌクレアーゼ“プルーフリーディング”活性がないため、酵素が有効に利用できるアンプリコンサイズが制限されます。Taqは、2 kb未満のDNA断片の増幅に最適であり、堅牢で反応の最適化が容易な酵素です。この酵素は3–4 kbまでの断片で機能しますが、長さが約3 kbを超えるアンプリコンでは効率が急速に低下します。

Hot-start PCRは、より高温に達するまで酵素を不活性にすることによって増幅をブロックするDNAポリメラーゼの修飾によって実現されています。一般的な修飾には抗体相互作用、化学修飾、アプタマー技術などがあります。PCRサイクル中に反応温度が許容範囲に達すると、阻害剤がポリメラーゼから解離し、反応が始まります。

抗Taq DNAポリメラーゼ抗体は、ポリメラーゼに結合して酵素を不活性化し、低温での初期のDNA増幅を防ぎます。最適なアニーリング温度に達すると、抗体の分解と解離が始まり、Taq DNAポリメラーゼ（Taq）を反応内に放出し、増幅プロセスが開始します。

化学的に修飾されたTaq DNAポリメラーゼ（Taq）には、特定のアミノ酸残基に熱不安定なブロッキング基が結合しています。これはPCR反応の最初の熱活性化ステップで除去されます。これによって、Taq DNAポリメラーゼ（Taq）は完全な活性を取り戻し、PCRサイクルを続行できます。
アプタマーを介したhot-start PCRでは、オリゴヌクレオチドアプタマーの結合によるTaq DNAポリメラーゼ（Taq）の機能が阻害されています。アプタマーは熱不安定な化学ブロッキング基や抗体よりも低温で酵素から解離するため、高温での活性化ステップが不要となり、Pされてロトコールが加速されます。さらに、アプタマーベースの阻害は完全に可逆的であるため、熱サイクル終了時にTaq DNAポリメラーゼ（Taq）活性もブロックされます。