クローニングおよびDNA組換え

E. coli DNA Polymerase Iの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性は、多くのアプリケーションには適していません。5'→3'ポリメラーゼと3'→5'プルーフリーディングエキソヌクレアーゼを含む大きなドメインであるKlenow Fragmentはこの活性を持たないため、有用な研究アプリケーションを提供します。これには、1本鎖テンプレートからの2本鎖DNAの合成、DNA断片の後退した3’末端のエンドフィリングによる5’オーバーハングの平滑化、突出している3’オーバーハングの消化、標識DNAプローブの調製などがあります。 

E. coli DNA Polymerase Iの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が望ましくないことがあるように、Klenow Fragmentの3'→5エキソヌクレアーゼ活性も特定のアプリケーションでは望ましくないことがあります。この問題は、5'→3’ポリメラーゼ活性は保持しているが、エキソヌクレアーゼ活性は持っていないKlenow Fragment（3'→5' exo-）酵素をもたらす突然変異を導入することによって克服します。Klenow Fragment（3'→5' exo-）は、マイクロアレイの蛍光標識反応の一部や、次世代シークエンシング用のDNAライブラリー調製に頻繁に使用されるDNA断片にDNAアダプターをライゲーションするプロセスの重要なステップであるdAおよびdTテーリングに使用されます。

T4ファージのDNAポリメラーゼは、E. coli DNA Polymerase I、Taq DNAポリメラーゼ、ミトコンドリアDNAポリメラーゼ（Taq）を含むポリメラーゼファミリーAのメンバーです。T4 DNAポリメラーゼは、標識または非標識dNTPで5’-オーバーハングをフィリングするため、または3'-オーバーハングを持つDNA分子から平滑末端を生成するために効果的に使用できます。T4 DNAポリメラーゼはテンプレート依存性であり、プライマーを必要とし、5’→3’エキソヌクレアーゼ機能を有していません。T4 DNAポリメラーゼは、ライゲーションに依存しないPCR産物クローニングに使用できます。 

ライゲーション非依存性クローニング（Ligation Independent Cloning：LIC）は、制限酵素/リガーゼクローニングに代わる技術です。インサートをPCR増幅し、ベクターを制限酵素消化またはPCRによって直線化します。LICはT4 DNA Polymeraseの3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、ベクターとインサートの間に相補性のあるオーバーハングを作成します。ワンステップSLIC（シークエンシングおよびライゲーション非依存性クローニング: Sequence and Ligation Independent Cloning）では、線形性ベクターとPCR増幅したインサートを一本のチューブ内で混合し、T4DNA Polymeraseで処理します。氷上で混合物をインキュベートして反応を停止し、混合物をコンピテントE. coli に導入した後、ギャップとオーバーハングを修復します。

T4 DNA Ligaseは、DNAとオリゴヌクレオチドの付着末端と平滑末端のいずれかをライゲーションできる酵素なので、ラボ研究で最も一般的に使用されている汎用性の高いリガーゼとなっています。T4 DNA Ligaseは、2本鎖DNAの1本鎖ニックを修復できますが、1本鎖核酸をライゲーションしません。T4 DNA Ligaseは、RNA:DNAハイブリッドにRNA分子が存在するとき、RNA分子を結合します。T4 DNA Ligaseによる付着DNA末端のライゲーションは、酵素活性とアニーリングしたDNAオーバーハングの間の安定性が良好なバランスを確保できるように、12–16°Cで実行できます。T4 DNA Ligaseは、65°Cで10分間インキュベートすることで熱不活化できます。