Scientist analyzing dPCR results on dPCR system
デジタルPCR

dPCRアッセイ開発とトラブルシューティング

デジタルPCRプロトコール —概要

デジタルPCR（dPCR）アッセイの開発は、テンプレート、使用する機器、アプリケーション、実験の目的などさまざまな要因に依存します。ほとんどのデジタルPCRプロトコールは、このようなステップのバリエーションを含んでいます：

サンプル調製  — dPCRアッセイ

サンプル調製は、高いPCR効率を達成するための重要なステップです。デジタルPCRの開始テンプレートを調製する際に考慮すべき重要なパラメーターがいくつかあります。

このような パラメーターに 含まれるもの：

  • サンプルの純度
  • 構造から見たサンプル の完全性
  • サンプルの長さとシークエンス
  • サンプルインプット量
  • レプリケートの使用
  •  コントロールの使用

より良いdPCRランを実現するためにこれら要素を最適化する方法については、以下で説明します。

Pipetting as the first step of sample preparation in a dPCR protocol

サンプルの純度

PCRは複数回の酵素反応に依存するため、シングルステップの酵素触媒反応に比べ、タンパク質、フェノール/クロロホルム、塩、EDTAなどの不純物に敏感です。汚染物質が蛍光検出を妨げる可能性があるため、dPCRでは核酸テンプレートの純度が重要です。

  • アルコール（エタノール、イソプロパノール）と塩は、プライマーとプローブのアニーリング特性を損ない、増幅効率を低下させます。たとえば、陽性の蛍光が減少し、陽性と陰性パーティションの識別が阻害されます
  • フミン酸は、dsDNA結合色素（EvaGreenなど）の蛍光を消します
  • ヌクレアーゼはRNAとDNAを分解します
  • 尿素とフェノールは、Taqポリメラーゼを変性させます
  • 酸性多糖類は核酸を模倣し、Taqポリメラーゼとデッドエンド複合体を形成します

qPCRに比べて阻害効果を受けにくいにもかかわらず、dPCRはテンプレート純度の高いテンプレートを用いると最適に機能します。ゲノムDNA、プラスミドDNA、トータルRNAなど、テンプレートに応じて、高い核酸純度とPCR効率を実現するためのさまざまなキットが存在します。

サンプル完全性：長さとシークエンス

アンプリコンの長さとシークエンスは、dPCR実験の成功を決定するとき、テンプレートの純度と同じくらい大きな影響を与えます。強く分解されたテンプレートRNAとDNAは、ODで定量したDNA量と、dPCRで増幅し検出したコピー数との間にずれを示す傾向があります。目的の感度を得るには、予想より多くのDNA量が必要な場合があります（変異検出などで）。特に、強く分解されたサンプル（FFPE DNA、cfDNA）を使用する場合は、アンプリコンをできるだけ短くすることをお勧めします。

同様に、残存する架橋結合は鎖の分離と増幅を妨げ、脱塩基部位は非特異的増幅を誘発する可能性があります。FFPEサンプルからの高品質gDNAの回収には、専用キットとプロトコールをご利用いただけます。

サンプル完全性：構造

dPCRプロトコールを用いて正確に定量するには、ランダムなテンプレート分割が非常に重要です。ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）DNA、循環セルフリーDNA（cfDNA）、相補的DNA（cDNA）、gBlockなど、ほとんどのテンプレートDNAで、PCRシグナルが均一に分布することが確認されています。

複雑な構造を持つ高分子テンプレートを均一に分配するには、制限酵素消化などの戦略を使用することをお勧めします。

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dPCR

以下のいずれかの場合には、デジタルPCRアッセイの前に制限酵素消化を使用することをお勧めします。

  • 高粘度溶液  – 高粘度は、特に少ない容量中で大量のDNAを使用すると、測定精度が低下する可能性があります。制限酵素消化を使用して粘度を下げると、dPCRプロトコールで、より高濃度のDNA（1 µg）を使用できます。
  • 結合またはタンデム遺伝子コピー  – 1つの陽性パーティションに複数のコピーが含まれている場合、結合したコピーは1コピーとしてカウントします。この問題は、制限酵素消化を使用して、遺伝子コピーを物理的に分離し、独立したパーティションに分離することで解決できます。
  • スーパーコイルプラスミド  – プラスミドDNAを線形化し、プライマー/プローブのDNAへの結合アクセスを改善し、効率を向上するために、制限酵素消化をお勧めします。これにより、プラスミドの定量精度が向上します。
  • 大きなDNA分子 (>30 kb)  – 大きなDNA分子は、不均一に分割され、テンプレート濃度の過剰定量につながる可能性があります。制限酵素消化により、大きなテンプレートを小さなサイズに断片化することで、均一な分配とより正確な定量が可能になります。
覚えておくべき注釈
制限酵素を選択するとき、酵素はアンプリコンシークエンス自体の中で切断すべきではありません。

サンプルインプット量

サンプルインプット量は使用するdPCRテクノロジーに依存します。QIAcuityナノプレートデジタルPCRでは、1反応あたり、26kナノプレートでは最大217,000コピー、8.5kナノプレートでは最大170,000コピーが使用可能です。

コピー数の計算方法

生物のハプロイドゲノムサイズが既知の場合、ゲノムDNA （gDNA）の質量インプット量と得られるコピー数（シングルコピー遺伝子の場合）の相関は、次の式で計算できます：

ゲノムサイズ（bp） x 単一塩基対の平均重量（1.096 x 10–21 g/bp） 

たとえば、ゲノムサイズが約3.3 x 109 bpのヒトゲノムの場合、以下のような計算になります：

3.3 x 109 bp x 1.096 x 10−21 g/bp = 3.3 x 10−12 g = 3.3 pg
下の表には、いくつかのモデル生物の10 ngのgDNAから得られたコピー数を示しています
覚えておくべき注釈
dPCRでは、平均コピー数/パーティション数は5を超えてはなりません。理想的には、0.5～3の範囲である必要があります。

レプリケート

ピペッティングエラーによる定量のバイアスを防ぐため、サンプルを2回または3回反復で分析することをお勧めします。2連データを足し合わせると、測定したイベント数が増えます。これはデジタルPCRアッセイの精度を高めるのに役立ちます。

コントロール

  • 陰性コントロール – 汚染やプライマーやプローブの問題によって発生する可能性がある偽陽性反応を監視するために必要です。陰性コントロールは、検出限界（LOD）の決定にも使用されます。
  • 陽性コントロール – 設定した反応条件下で、テンプレートの増幅が起こるかどうか調べるために使用します。
  • テンプレートなしのコントロール（NTC） – すべての試薬の汚染を照合します。
QIAcuityシステムにおけるデジタルPCR：はじめに
このウェビナーでは、テンプレートの選択とその濃度に重点を置いて、QIAcuity機器でのデジタルPCRのさまざまな基本的側面を取り上げます。
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検出ケミストリー

DNA結合色素

EvaGreenなどの蛍光挿入DNA色素は、すべての2本鎖DNA分子に結合し、結合すると、特定の波長の蛍光シグナルを発します。シグナル強度は、サイクル数が増加するにつれてPCR産物が蓄積するため、増加します。EvaGreenのようなDNA結合色素を使用すると、数多くのさまざまなターゲットの分析が可能になりますが、ターゲット特異的標識プローブを合成する必要はありません。しかし、非特異的PCR産物とプライマーダイマーが、蛍光シグナルに寄与し、デジタルPCRデータ分析中に蛍光シグナルの別のクラスターとして現れる可能性すらあります。EvaGreen色素を使用する場合は、高いPCR特異性が不可欠です。 

Fluorescence detection using DNA intercalating dyes in digital PCR
Fluorescence detection using primers/probes in digital PCR

加水分解プローブ

TaqManプローブと呼ばれる加水分解プローブは、蛍光色素とクエンチャー分子が結合したシークエンス特異的なオリゴヌクレオチドです。蛍光色素はプローブの5'末端に結合し、クエンチャーは3'末端または目的のシークエンスの内部に結合します。PCRの伸長期に、プローブがTaq DNAポリメラーゼの5′→3′エキソヌクレアーゼ活性によって分解され、蛍光色素とクエンチャー分子が分離します。その結果、蓄積したPCR産物の量に比例する蛍光シグナルを検出できます。

dPCRのトラブルシューティングのヒントとして、レポーターとクエンチャーの特定の組み合わせを避ける必要があります。たとえば、クエンチャーの発光が蛍光色素の発光と重なると、対応する蛍光チャンネルに追加のバックグラウンドシグナルが発生します。このバックグラウンドノイズは、クラスター分離とピーク分解能に悪影響を及ぼします。 

プライマーとプローブの設計方法

デジタルPCRアッセイの成功には、効果的なプライマーとプローブの設計が不可欠です。dPCRプロトコールのプライマーとプローブの設計は、qPCRアッセイと同じルールに従います。プライマーとプローブの設計で重点を置く分野は以下の通りです：

  • ターゲットマッチング
  • 塩基組成
  • アンプリコン長
  • 融解温度
  • 二次構造が無いこと
  • 自己相補性および相互相補性が無いこと（セルフアニーリング）
  • 交差反応性が無いこと
Optimizing primer design and probe design for digital PCR assays
デジタルPCRプロトコールのためのプライマーとプローブの設計の違いのひとつは、dPCRのプライマーとプローブの濃度がqPCRより高くなる傾向があることです。プライマーとプローブの濃度が高いと蛍光強度/増幅度が大きくなり、バックグラウンドノイズと特定のシグナルをよりうまく分離できます。最終的には、より正確なターゲット定量を達成できます。反応あたり、プライマーの最終濃度を0.5 µM – 0.9 µMに、プローブの最終濃度を0.25 µMに設定すると、最適な結果が得られることがエビデンスによって示唆されています。

プライマーとプローブの保存

注意深いアッセイ設計と、適切な濃度のプライマーとプローブの使用とは別に、プライマーとプローブの正しい保存もdPCRの成功には不可欠です。

凍結乾燥したプライマーとプローブは、100 µM TEバッファー（10 mM Tris・Cl、1 mM EDTA、pH 8.0）などの少量の低塩バッファーに溶解し、濃縮ストック溶液を調製する必要があります。例外として、Cy5およびCy5.5蛍光色素で標識したプローブは、pHが高くなると分解する傾向があるので、Buffer TE、pH 7.0で保存する必要があります。

プライマーを保存する場合、ヌクレアーゼフリーTEバッファー中に少量分注されたものは-20℃で少なくとも1年間保存できます。蛍光標識プローブは、このような同じ条件下で6～9ヶ月間安定しています。分解リスクを減らすために、凍結融解サイクルの繰り返しを避ける必要があります。

dPCRマルチプレックスアッセイ用のプライマー-プローブセットでは、20xプライマー-プローブミックスを使用し、推奨濃度の特定のターゲットに2つのプライマーと1つのプローブを使用できます。

プライマーとプローブを再構成するには、凍結乾燥したプライマーまたはプローブを含むチューブを穏やかに遠心分離し、チューブの底にあるすべての物質を回収する必要があります。必要量の滅菌ヌクレアーゼフリーTEバッファーを加え、混合し、20分間放置してプライマーまたはプローブを完全に溶解する必要があります。プライマーまたはプローブの溶液を再度混合し、分光光度計で濃度を測定する必要があります。dPCRのトラブルシューティングのヒントは、プライマーやプローブを水に溶解しないことです。このようなプライマーやプローブの中には、TEバッファーよりも水への溶解度や安定性が低いものがあります。 

dPCRランを実行

A representation of the nanoplate dPCR workflow

標準的なナノプレートdPCRワークフローでは、サンプルロード、増幅、データ解析という3つの主要な反応ステップがあります。

dPCR反応ステップを最適化するとき、高品質のqPCR結果が得られるqPCR 条件を直接、dPCRに適用できることがよくあります。しかし、特定の要件については、製造業者の推奨事項を確認することを常にお勧めします。 

サンプルロードのヒント

3つのdPCR反応ステップの最初のステップは、サンプルの調製とロードです。PCRミックスを調製し、ナノプレートをロードするとき、以下の推奨事項を考慮してください。

  • 作業スペースと実験器具を除染し、外来DNA汚染のリスクを低減します
  • 最大限のPCR効率を確保するには、メインのデジタルPCRアッセイの前に、さまざまな希釈液中のサンプルをテストしてください。
  • 反応混合物を調製する前にすべての成分を完全に解凍し、均質な溶液を得られるように成分を十分に混合し、スピルオーバーしないように短時間遠心します。
  • マスターミックスとサンプル、プライマー、RNAaseフリー水、もし使用する場合は制限酵素も混ぜ合わせます
  • 滅菌ピペットチップを使用
  • 反応混合液をナノプレートにピペットで移します。サンプルを移す際やプレートのダウンストリーム輸送中に、dPCRナノプレートのウェルに気泡が混入しないようにしてください
  • 蒸発や汚染を防ぐため、ローラーを使用してナノプレートをフィルムで慎重に密閉します
  • dPCR反応ミックスがインプットウェルの底に留まるように、振ったり回転させたりしないで、プレートの側端のみを持ち、ナノプレートをdPCR装置に運びます
  • ソフトウェアをセットアップし、dPCRランを開始

増幅のヒント

3つのdPCR反応ステップの2番目のステップでは、増幅を通じてdPCRプロトコールを実行します。このステップでは、各ウェルの反応ミックスが何千もの個々の反応に分離します。PCR反応はサーモサイクラーで実行されます。テンプレート材料がパーティション内に存在すると、イメージング中に陽性蛍光シグナルが検出されます。画像は専用ソフトウェアで処理されます。現在のプレートの状態は通常、dPCR装置自体または接続したソフトウェアスイートを使用してモニターできます。

最適な増幅条件とPCR効率を達成するためのヒントは以下の通りです。

  • アニーリング温度 - dPCRアッセイの特異性に影響を与える可能性があります。通常、55℃から65℃の間に設定され、最適なアニーリング温度は、陽性パーティションと陰性パーティションの間の分離が最大になった時に得られます。アニーリング温度を上げると、陽性シグナルとバックグラウンドノイズの分離を改善するのに有効な場合があります
  • 増幅サイクル - 陽性シグナルとバックグラウンドノイズを十分に分離するために、少なくとも40回の増幅サイクルを実行することをお勧めします。場合によっては、最適な性能を得るために熱サイクルの回数を増やさなければならないこともあります。

デジタルPCRデータ分析

3つのdPCR反応ステップの最後のステップは、ポアソン統計に基づく絶対定量によるデジタルPCRデータ分析です。

QIAcuity Software Suiteは、絶対定量、変異検出、ゲノム編集、コピー数多型、遺伝子発現などのアプリケーションの目的に応じて、デジタルPCRデータ分析を実行できます。絶対定量分析（第1レベル分析）で、ソフトウェアは、選択したウェルの濃度図と陽性および陰性パーティション図を作成します。ヒートマップビューでは、ターゲットチャンネルとリファレンスチャンネルを並べて表示します。ヒストグラムと散布図を使用して、閾値の設定を変更し、結果を再計算できます。QIAcuity Software Suiteでは、プレートの分析結果に関するレポートを作成できます。絶対定量は、その後のすべての計算と第2レベル分析（変異検出分析、遺伝子発現分析、コピー数多型分析など）の前提条件です。

デジタルPCRデータ分析のヒント： 

  • 陰性パーティションのクラスターのすぐ上で、パーティションを陽性か陰性かに分類するための閾値を設定します
  • 閾値の設定には、陰性パーティションのみを含むNTCサンプルを使用しますが、全てのウェルの検査も実施します
  • 個々のウェルの蛍光振幅をNTCよりもわずかに高く、あるいは低く設定すると、一部のパーティションの誤分類を避けることができます
  • コンセンサス値は存在しませんが、通常、陽性パーティション数が2を超えると、反応を陽性とみなします
  • ウェル間およびバッチ間のバラツキに対処するため、volume precision factor（VPF）（容積精度係数）を使用して各ウェルの正確な容積を定義し、ソフトウェアによる濃度計算にその係数を適用してください。
デジタルPCRデータの例
QIAcuityデジタルPCRアプリケーションガイド
dPCRアプリケーションの実験セットアップやデータ分析の実施に関する詳細な情報をご覧いただけます。
ガイドを入手する

デジタルMIQE（dMIQE）ガイドライン

デジタルPCR実験公開のための最小情報（dMIQE）ガイドラインは当初 、qPCR結果の再現性と比較可能性を確保するために作成されましたが、デジタルPCRプロトコールにも適用されました。この一連のガイドラインは、dPCRデータの作成と公表に使用され、dPCRアプローチを調和させ、異なるラボ間で容易に解釈できる意味のある結果を提供することを目的としています。

dMIQEガイドラインは、方法と結果を再現し、追跡し、理解できるように、dPCR実験の結果を公表するための項目のチェックリストを提供します。dMIQEガイドラインは、実験の再現性を容易にするために使用され、使用するdPCRテクノロジーに関係なく、研究の技術的品質の分析とレビューに重要な情報を提供します。

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Researchers optimizing dPCR assays and remaining compliant with dMIQE guidelines

dMIQEガイドラインのチェックリストの項目は、dPCRの結果を公表する際の報告に必須とされています。報告が必要な情報は以下の通りですが、これらに限定されません。

  • パーティションあたりの平均DNAターゲットコピー数（λ）
  • 使用したパーティション数（平均DNAターゲットコピー数と合わせて、これら値によってdPCRアッセイの精度を決定できます）
  • サンプルの性質がデータの精度や信頼性に影響を与える可能性があるため、テンプレートの構造情報：
    • 個々のパーティションテンプレートのタイプ：ゲノム、プラスミドなど
    • ソース：生物、組織、細胞、食品、植物など
    • 処理：制限酵素消化、超音波処理、前増幅、希釈、なし
  • 個々のパーティション容量。この容量はdPCRプラットフォームによって異なる可能性があるため。
  • 総反応量：パーティション数にパーティション量を乗じることで算出できます
  • 使用するコントロールのタイプ
  • 陽性および陰性実験データの代表的な増幅プロットまたはエンドポイント蛍光値
  • 実験の不確実性をより正確に把握するために、できれば複数の生物学的レプリケートから得られる実験のばらつきの例
  • その他
ホワイトペーパー：デッドボリュームの把握と取り組み
デッドボリュームは、dMIQEガイドラインの重要なパラメータです。デッドボリュームの制限を克服して高いdPCR感度を実現する方法について詳しく説明します。 
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qPCRからdPCRにアッセイに移行して最適化する方法

real-time PCRアッセイ の設計に関する考慮事項は、デジタルPCRプロトコールにもあてはまります。満足のいくqPCR結果が得られるアッセイは、dPCRでも成功します。最初は検証済みqPCRメソッドの濃度を使用するのが賢明ですが、陽性パーティションのエンドポイント蛍光値の改善が必要な場合は、プライマー/プローブの濃度勾配を実行することをお勧めします。上記セクションで概説したように、蛍光色素の適合性、dPCRの推奨サーマルサイクリング条件、プライマー/プローブ濃度にも注意を払う必要があります。
dPCRアッセイ最適化のパラメーター

しかし、新しいアッセイを導入する際には常に、最初にパイロットテストを行って性能を評価することを推奨します。また、適切なバックグラウンドマトリックスで、十分に特性を明らかにした代表的なコントロールを使用することを推奨します。性能が最適でない場合は、分析精度を確保するためにアッセイを最適化する必要があります。このような場合、最適化プロセスの詳細を報告することが再現性のために重要です。

最適ではないアッセイを迅速に最適化するには、アニーリングステップの温度勾配を実施しますが、QIAcuityマスターミックスはどのようなreal-time PCR装置でも実行できます。

ホワイトペーパー：qPCRとdPCRの精度と感度の比較
qPCRとdPCRの性能を比較するデータを調査し、どちらの方法がアプリケーションに適しているか、情報に基づいて判断します。
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デジタルPCRトラブルシューティング

dPCR実験は、qPCRや伝統的または従来のPCRと同様の問題に影響されることがあります。しかし、デジタルPCRアッセイを行う際に、いくつかの特定の課題が発生する可能性があります。以下の表は、典型的なdPCRプロトコールでよく発生する問題に対するdPCRトラブルシューティングガイドとして使用でき、考えられる原因と専門家の推奨事項を概説しています。

dPCR最適化によりさらにサポート

参考文献

Iowa Institute of Human Genetics – Droplet Digital PCR (accessed January 20, 2023)

Lindner L et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies. Methods. 2021; 191(4):95-106.

Pecoraro S et al. Overview and recommendations for the application of digital PCR. EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019

QIAGEN. QIAcuity User Manual Extension. June 2021.

Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 2012; 113(5):1014-1026.

Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020; 412:2009-2023. 

The dMIQE Group and Hugget JF. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. 2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.