核酸定量に関連する分子生物学やゲノミクス研究に関して、科学者たちはしばしば、自分たちが岐路に立っていることに気づきます。研究目標を効率的に達成するためにどの定量技法を選択すべきか – より正確で確実なデジタルPCR（dPCR）か、あるいはより標準化され、使い慣れた定量的real-time PCR（qPCR）か。選択すべきものはアプリケーションによって異なります。好奇心旺盛な方のために、この記事では、これら2つの世代のPCR技法の技術的進化と実際のアプリケーションについて簡単に説明します。
1993年の発見以来、研究者はqPCRの速度、感度、特異性、使いやすさを高く評価しています。この技法は、遺伝子発現実験、SNP検出、遺伝子型決定、対立遺伝子識別を実行し、マイクロアレイデータを検証するときに最も有用性を発揮します。綿密に設計されたqPCRアッセイでは、反応ごとにターゲットシークエンスの複数のコピーを検出できるため、幅広い動的定量範囲が可能です。挿入色素（SYBR Green）から特定ターゲットプローブ（TaqMan、分子ビーコンなど）まで、検出ケミストリーを選択できます。1 サンプルあたりのコストは非常に柔軟で、反応量、スループット、検出メソッドに適応し、特定の研究ニーズを満たすことができます。さらに、qPCRのMIQEガイドラインが発表され、ラボ間の一貫性が促進され、実験の再現性が向上しました。2
またその一方で、コピー数多型やまれなイベントの検出など、優れた精度と感度を必要とするアプリケーションでは、qPCRが低下することがわかりました。このようなアプリケーションで、dPCRは、絶対コピー数測定だけでなく、検出限界を克服することで、qPCRを上回りました。すなわち、わずかな発現量の差や存在量の少ないターゲットを検出すること、つまり干し草の山から針1本を見つけることができるのです。デジタルPCRは、標準曲線が不要であり、パーティションのエンドポイント蛍光を読み取るため、阻害物質に低い感受性を示します。エラー率は、PCR効率バイアスを取り除くことによって減少しました。これは、科学界が間違いなく高く評価していることです。3
皮肉なことに、1990年代初頭には“限界希釈PCR”または”デジタルPCR”の登場が見られたにもかかわらず、その進歩はすぐにreal-time PCRの到来によって妨げられました。4,5それはなぜでしょうか？ 機器と化学の欠如です。幸いにして、最近のレビューでは、このテクノロジーが将来にわたり有望視されています。6 デジタルPCRは、シンプルにオール・オア・ナッシングのアプローチを提供します。このことは、継続的な技術的な進歩とMIQEガイドラインの発表と相まって、その潜在性を最大限に引き出すことに関心を呼び戻しています。7今日、ますます多くの科学者たちが、がん遺伝子突然変異の研究、免疫療法の有効性モニタリング、病原体の検出、GMOの解析、遺伝子編集頻度の評価、遺伝病の出生前検査のためにdPCRを採用することに目を向けており、そのアプリケーション領域は拡大しています。8
2. Bustin S.A. et al. MIQEガイドライン：定量的real-time PCR実験公開のための最小限の情報。Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. 少量のターゲットを用いる遺伝子発現分析に対するドロップレットデジタルPCRとqPCRの比較：可変ナンセンスから公開品質データまで。Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. 限界希釈を使用するPCRのターゲットの定量。BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: 簡単な歴史。Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: テクノロジー レビュー。Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. デジタルMIQEガイドライン：定量的real-time PCR実験公開のための最小限の情報。Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. 一歩を踏み出したデジタルPCR。Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.
1993年の発見以来、研究者はqPCRの速度、感度、特異性、使いやすさを高く評価しています。この技法は、遺伝子発現実験、SNP検出、遺伝子型決定、対立遺伝子識別を実行し、マイクロアレイデータを検証するときに最も有用性を発揮します。綿密に設計されたqPCRアッセイでは、反応ごとにターゲットシークエンスの複数のコピーを検出できるため、幅広い動的定量範囲が可能です。挿入色素（SYBR Green）から特定ターゲットプローブ（TaqMan、分子ビーコンなど）まで、検出ケミストリーを選択できます。1 サンプルあたりのコストは非常に柔軟で、反応量、スループット、検出メソッドに適応し、特定の研究ニーズを満たすことができます。さらに、qPCRのMIQEガイドラインが発表され、ラボ間の一貫性が促進され、実験の再現性が向上しました。2
またその一方で、コピー数多型やまれなイベントの検出など、優れた精度と感度を必要とするアプリケーションでは、qPCRが低下することがわかりました。このようなアプリケーションで、dPCRは、絶対コピー数測定だけでなく、検出限界を克服することで、qPCRを上回りました。すなわち、わずかな発現量の差や存在量の少ないターゲットを検出すること、つまり干し草の山から針1本を見つけることができるのです。デジタルPCRは、標準曲線が不要であり、パーティションのエンドポイント蛍光を読み取るため、阻害物質に低い感受性を示します。エラー率は、PCR効率バイアスを取り除くことによって減少しました。これは、科学界が間違いなく高く評価していることです。3
皮肉なことに、1990年代初頭には“限界希釈PCR”または”デジタルPCR”の登場が見られたにもかかわらず、その進歩はすぐにreal-time PCRの到来によって妨げられました。4,5それはなぜでしょうか？ 機器と化学の欠如です。幸いにして、最近のレビューでは、このテクノロジーが将来にわたり有望視されています。6 デジタルPCRは、シンプルにオール・オア・ナッシングのアプローチを提供します。このことは、継続的な技術的な進歩とMIQEガイドラインの発表と相まって、その潜在性を最大限に引き出すことに関心を呼び戻しています。7今日、ますます多くの科学者たちが、がん遺伝子突然変異の研究、免疫療法の有効性モニタリング、病原体の検出、GMOの解析、遺伝子編集頻度の評価、遺伝病の出生前検査のためにdPCRを採用することに目を向けており、そのアプリケーション領域は拡大しています。8
今後の方法
real-timeおよびデジタルのPCRテクノロジーは、将来的に大きく成長する可能性を秘めています。qPCRは引き続き実験室の標準的な主力製品ですが、dPCRの魅力的な感度、精度、確実性、再現性は、科学者が既存の限界を押し広げることに貢献します。最先端のナノプレートベースdPCRテクノロジーの導入により、デジタルへの切り替えを検討している実験室は、多重化とスループットがもたらす多大なメリットを享受できます。産業界と学界は、激しい競争が繰り広げられるこの環境に適応し、絶え間なく変化するPCRの世界で自分たちの完璧な立ち位置を見つける必要があります。参考文献
1. Deepak S.A. et al. Real-Time PCR: 遺伝子の検出と発現解析に革命をもたらす。Curr. Genom. 2007;8:234–251.2. Bustin S.A. et al. MIQEガイドライン：定量的real-time PCR実験公開のための最小限の情報。Clin Chem 2009;55:611–622.
3. Taylor S.C. et al. 少量のターゲットを用いる遺伝子発現分析に対するドロップレットデジタルPCRとqPCRの比較：可変ナンセンスから公開品質データまで。Sci. Rep. 2017;7:2409-2417.
4. Sykes P.J. et al. 限界希釈を使用するPCRのターゲットの定量。BioTechniques. 1992;13(3):444–449.
5. Morley A.A. Digital PCR: 簡単な歴史。Biomol. Detect. Quantif. 2014;1:1–2.
6. Quan P.L. et al. dPCR: テクノロジー レビュー。Sensors (Basel). 2018;18 pii:E1271.
7. Huggett J.F. et al. デジタルMIQEガイドライン：定量的real-time PCR実験公開のための最小限の情報。Clin. Chem. 2013, 59, 892– 902.
8. Baker M. 一歩を踏み出したデジタルPCR。Nat. Methods 2012, 9, 541– 544.