Custom miRCURY LNA miRNA Detection Probes

1. 低濃度のmiRNAを検出する優れた感度と特異性
2. 新規miRNA配列を標的とするカスタムデザインプローブ
3. ラベルの幅広い選択肢により、多色検出が可能
4. 標準化されたプロトコールが自動化された高スループットISHに最適
5. 迅速かつ簡単なmiRNA ISHプロトコール

Custom miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、新規miRNや設計済みmiRCURY LNA miRNA Detection Probesに含まれないmiRNAおよび、その他の短い配列やncRNA配列の特異的検出を可能にします。これらのカスタムmiRNA検出プローブは、LNA 技術で強化された設計済みのmiRNA検出プローブと同様のガイドラインにしたがって、弊社技術者によって設計されます。

研究プロジェクトでのお見積り、または弊社専門チームとのプロジェクトについて、ご希望がありましたら、 こちら　よりお気軽にご相談ください。

最適化されたカスタマイズISHコントロールプローブ

Custom miRCURY LNA miRNA Detection Probes は、小さなRNA 配列を検出するのに最適で、ISH 実験で優れたコントロールとしても機能します。 弊社では、さまざまな方法でカスタムプローブを設計しており、ISH 実験におけるその特異性を体感していただけます。 どのような実験でもコントロールと同様の良い結果が期待できます。ISH の場合、単一の最良のコントロールは存在しないので、観察される発現パターンに対する信頼性を提供するために、できるだけ多くのコントロールを有することが好ましいです。 

ミスマッチネガティブコントロールプローブとしての使用に最適

ミスマッチプローブは、ターゲットプローブと一緒に使用するために特別に設計されたカスタムです。 ミスマッチプローブはターゲットに対して1～3ヌクレオチドのミスマッチを持ちます。弊社のLNA設計の専門家は、ターゲットプローブのT_m値に近似するように、最適なミスマッチ数およびLNA位置を同定して設計を行います。

連続切片上で同じISHプロトコールを使用すると、ミスマッチネガティブコントロールプローブでは、全く染色されないか、されたとしてもわずかな染色のみです。カスタムミスマッチネガティブコントロールプローブの例として、以下の刊行物のFigure 1Fが挙げられます:  Nielsen et al. (2011). High levels of microRNA-21 in the stroma of colorectal cancers predict short disease-free survival in stage II colon cancer patients. Clin Exp Metastasis. 28(1):27–38. PMID: 21069438. 

ターゲット特異的ポジティブコントロールプローブ

短い長さのLNAプローブは、成熟miRNAの短い配列内であっても、数塩基程度ずらして設計することで異なる領域を標的とする代替プローブとして設計をすることが出来ます。（Binding sites of four different LNA probes targeting the mature and precursor miRNA-21参照）。異なるプローブで同じmiRNAに対して、同様のハイブリダイゼーションパターンを得ることは、ISH実験におけるポジティブコントロールとして重要なことです。弊社のLNA専門家は、LNAポジションとターゲットプローブのT_m値と近似させることでの代替プローブをカスタムデザインすることができます。

Pre-miRNA検出プローブ

非特異的なクロスハイブリダイゼーションを排除するための別のポジティブコントロールプローブは、前駆体miRNAのループ配列に結合するように設計されたループ指向型プローブです。 このプローブは、成熟miRNA配列に結合するターゲットプローブと同じハイブリダイゼーションパターンを確認します。しかし、pre-miRNAの発現レベルは、成熟miRNAの発現レベルよりも低い可能性が高いと思われます。

ループ特異的プローブを含むターゲット特異的ポジティブコントロールプローブの例として、以下の刊行物のFigure 1が挙げられ挙げられます: Rask et al. (2011) High expression of miR-21 in tumor stroma correlates with increased cancer cell proliferation in human breast cancer. APMIS. 119(10):663-73. PMID: 21917003. 

カバレッジ

Custom miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、miRNAターゲット用のプレデザインプローブが利用できない場合に最適です。 このプローブは、in situ ハイブリダイゼーション（ISH）およびノーザンブロッティングに非常に適しています。 プローブは、3'、5'または両方（3'および5'）に、DIG、ビオチンおよびフルオレセイン（FAM）の標識をすることができます。 カスタムラベリング用のReady-to-Label probesもご用意があります。

miRNA ISHのOne-day プロトコール

miRNA ISHのOne-day プロトコールは、FFPE組織切片のmiRNAの検出のために設計されました。このプロトコールは、非哺乳動物ハプテンジゴキシゲニン（DIG）またはフルオレセインを使用し、実験を1日で終わるように最適化されています。 まず、miRNAをProteinase Kを用いて露出させ、二重DIGまたは二重フルオレセイン標識したLNAプローブがmiRNA配列にハイブリダイズさせます。 DIGまたはフルオレセインハプテンは、アルカリホスファターゼ（AP）をコンジュゲートさせている特異的　抗DIGまたは抗フルオレセイン抗体によってそれぞれ認識させます。そして APは、可溶性基質4-ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）および5－ブロモ－4－クロロ-3'－インドリルホスフェート（BCIP）を暗青色の沈殿物に変換し組織に局在を示す着色を行います。 切片をカウンターステインすれば、結果をより明瞭にできます。

免疫組織染色（IHC）および病理学研究室などでの応用

miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、バイオバンク保管材料などの新鮮な凍結組織およびホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織からのそのままの検体やシングルセルそして切片を含む、様々な組織および細胞調製物において有用です。このようにこれらのプローブは、FFPEサンプルの日常的なISH分析に使用することができます。 プローブは、発色または蛍光検出の両方を使用する様々なISHプロトコールと互換性があります。さらに、弊社のISHプロトコールを免疫組織染色（IHC）と共に使用して二重染色を行うことができます。

miRCURY LNA miRNA Detection ProbesのLNA技術 は、プローブの親和性を高め、T_m値の標準化をし、そしてすべてのプローブが同一条件下で最適に機能することを確実にします。これにより、優れた標準化プロトコールの構築が容易になり、プローブは自動ISHプロトコールでの使用に最適なツールになります。さらに、SN比が高いため、自動画像解析も容易になります。

FFPE ISHのための提言

FFPE組織切片でのmiRNA ISH実験については、miRNA ISHのOne-dayプロトコールをご使用をおすすめします。二重標識プローブをご使用の場合は、キットハンドブックをご参照ください。このプロトコールは、miRCURY LNA miRNA Detection Probesを使用するために最適化されており、免疫組織染色プロトコールと比較して、ステップが少ない迅速な操作手順になっています。miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set（FFPE）は、miRCURY LNA miRNA Detection Probes用に開発されています。

miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、細胞内および細胞内小器官でのmiRNAの局在研究や空間的なmiRNA発現の検出、もちろんノーザンブロッティングなどの多数のアプリケーションに使用できます。 ISH手順の優位性は、ハイスループットISH分析と個々のmiRNAの局在研究の両方で使用するための優れたツールということです。