Ni-NTA Magnetic Agarose Beads

Hisタグ付きタンパク質のハイスループット、微小規模精製、およびHisタグを使用する多用途磁気捕捉アッセイ用

Products

Features

シグナル対ノイズと再現性を高めるために指示された提示
ビーズの数を変えることで、幅広い結合能を実現
粗細胞溶解物でも効果的なスクリーニング手順
生体分子相互作用の研究に最適
完全自動化用オプション

Product Details

Ni-NTA Magnetic Agarose Beadsは、Ni-NTA Agaroseアフィニティー精製マトリックスでコーティングされた磁性粒子です。Hisタグを持つ組み換えタンパク質の固定化と精製に使用します。Hisタグのヒスチジン残基は、固定化したニッケルイオンの配位圏の空いた位置に、高い特異性と親和性で結合します。タンパク質が結合すると、磁石を使ってビーズを沈殿させ、洗浄し、天然または変性条件下で少量のバッファーにタンパク質を溶出させることができます。

Principle

Ni-NTA Magnetic Agarose Beads（図 Ni-NTA Magnetic Agarose Beadsの顕微鏡写真を参照）を含むQIAexpress Ni-NTAタンパク質精製システムは、6個以上のヒスチジン残基のアフィニティタグ（Hisタグ）を含むタンパク質に対する特許取得済みのNi-NTA（ニッケル-ニトリロ三酢酸）樹脂の優れた選択性に基づいています。この技術により、天然または変性条件下で、あらゆる発現系からほぼすべてのHisタグ付きタンパク質をワンステップ精製できます（図 Ni-NTAタンパク質精製システムによるタンパク質の精製を参照）。ニッケルイオンに対して4つのキレート部位を持つNTAは、金属イオンとの相互作用に利用できる部位が3つしかない金属キレート精製システムよりもしっかりとニッケルに結合します。余剰のキレート部位がニッケルイオンの浸出を防ぐため、他の金属キレート精製システムを使用した場合よりも結合能が高く、より高純度のタンパク質調製物が得られます。QIAexpressシステムを使用すると、バキュロウイルス、哺乳類細胞、酵母、細菌など、あらゆる発現系からHisタグ付きタンパク質を精製できます。

See figures

Ni-NTA Magnetic Agarose Beadsの顕微鏡写真

微小規模タンパク質精製

Procedure

Hisタグ付きタンパク質の精製は、細胞溶解、結合、洗浄、溶出の4段階で構成されています（図微小規模タンパク質精製を参照）。QIAexpressシステムを用いる組み換えタンパク質の精製は、タンパク質やHisタグの3次元構造に依存しません。これにより、希釈溶液や粗溶解物から、天然または変性条件下で、タンパク質をワンステップ精製できます。受容体、膜タンパク質、封入体を形成するタンパク質の効率的な可溶化と精製には、強力な変性剤や洗浄剤を使用できます。非特異的に結合する汚染物質を効率的に除去できる試薬を洗浄バッファーに含めることができます（表を参照）。精製したタンパク質は、競合剤として100～250 mMのイミダゾールを加えるか、pHを下げることにより、穏やかな条件下で溶出します。

His/Ni-NTA相互作用に対応する試薬
変性剤	界面活性剤	還元剤	その他	塩	長期保存用
6 M Gu·HCl	2% Triton X-100	20 mM β-ME	50%グリセロール	4 M MgCl₂	最大30%エタノール
8 M尿素	2% Tween 20	10 mM DTT	20%エタノール	5 mM CaCl₂	または100 mM NaOH
	1% CHAPS	20 mM TCEP	20 mMイミダゾール	2 M NaCl

See figures

微小規模タンパク質精製

Applications

Ni-NTA Magnetic Agarose Beadsを含むQIAexpress Ni-NTAタンパク質精製システムは、以下を含むあらゆるアプリケーションに適したタンパク質を高い信頼性でワンステップ精製します。

構造および機能研究
三次元構造決定のための結晶化
タンパク質-タンパク質およびタンパク質-DNA相互作用を含むアッセイ
抗体を産生するための免疫付与

Supporting data and figures

微小規模タンパク質精製

Resources

Publications

A highly specific system for efficient enzymatic removal of tags from recombinant proteins.

Schäfer F; Schäfer A; Steinert K;

J Biomol Tech; 2002; 13 (3):158-71 2002 Sep PMID:19498979

Modulating RssB activity: IraP, a novel regulator of sigma(S) stability in Escherichia coli.

Bougdour A; Wickner S; Gottesman S;

Genes Dev; 2006; 20 (7):884-97 2006 Apr 1 PMID:16600914

Bending fatigue study of nickel-titanium Gates Glidden drills.

Luebke NH; Brantley WA; Alapati SB; Mitchell JC; Lausten LL; Daehn GS;

J Endod; 2005; 31 (7):523-5 2005 Jul PMID:15980713

Ionic interactions between PRNA and P protein in Bacillus subtilis RNase P characterized using a magnetocapture-based assay.

Day-Storms JJ; Niranjanakumari S; Fierke CA;

RNA; 2004; 10 (10):1595-608 2004 Aug 30 PMID:15337847

Human phosphatidylinositol 4-kinase isoform PI4K92. Expression of the recombinant enzyme and determination of multiple phosphorylation sites.

Suer S; Sickmann A; Meyer HE; Herberg FW; Heilmeyer LM Jr;

Eur J Biochem; 2001; 268 (7):2099-106 2001 Apr PMID:11277933

FAQ

When working with small amounts of 6xHis-tagged protein in dilute solution, such as proteins expressed in mammalian cells or secreted into cell-culture medium, we recommend using Ni-NTA Magnetic Agarose Beads.

The total binding capacity of Ni-NTA Magnetic Agarose Beads is 3 µg of protein per 10 ul of magnetic bead suspension. Adjusting the amount of beads to the amount of 6xHis-tagged protein to be captured is crucial for optimal performance. The small elution volumes used provide high 6xHis-tagged protein concentrations, and allow detection of the purified proteins using Coomassie-stained SDS polyacrylamide gels.

Please see protocol 15 in the QIAexpressionist Handbook for detailed descriptions of a procedure to purify 6xHis-tagged proteins from transfected mammalian cells.

FAQ ID -134

Imidazole does not interfere with most downstream applications and therefore does not need to be removed. If it is necessary to remove the imidazole (e.g., for some sensitive enzyme assays), it can be easily achieved by dialysis, precipitation (e.g., ammonium sulfate), or ultrafiltration.

FAQ ID -91

FEATURES	BENEFITS
The interaction of the 6xHis tag with Ni-NTA matrices is conformation independent	One-step purification can be carried out under native or denaturing conditions
Mild elution conditions can be used	Binding, washing, and elution are highly reproducible, and have no effect on protein structure. Pure protein products are ready for direct use in downstream applications
The 6xHis tag is much smaller than other commonly used tags	6xHis tags can be used in any expression system. The Tag does not interfere with the structure and function of the recombinant protein
The 6xHis tag is uncharged at physiological pH	The 6xHis tag does not interfere with secretion
The 6xHis tag is poorly immunogenic	The recombinant protein can be used without prior removal of the tag as an antigen to generate antibodies against the protein of interest
Using Factor Xa Protease, 6xHis tag can be easily and efficiently removed	The detagged protein can be used for crystallographical or NMR studies where removal of the 6xHis tag may be preferred
Some QIAexpress vectors feature a 6xHis-dihydrofolate reductase tag (6xHis-DHFR tag)	Small peptides fused to the 6xHis DHFR tag are stabilized while being expressed. The 6xHis-DHFR tag is not highly immunogenic in mouse and rat, so that peptides fused to the tag can be used directly for immunizations or epitope mapping

FAQ ID -193

Yes, Ni-NTA Agarose and Superflow will bind a 6xHis-tag whether it is located internally or at the C- or N-teminal end of the protein. Note that the His-tag must be exposed for binding at the surface of the protein to allow for efficient purification under native conditions.

FAQ ID -496

Yes, please follow the Supplementary Protocol 'Purification of 6xHis-tagged proteins using the BioSprint 96 Workstation' (BS17).

FAQ ID -1167

Use 10-20 mM imidazole in the lysis and wash buffers (both for native and denaturing conditions). Optimal imidazole concentrations have to be determined empirically.
Increase the NaCl concentration (up to 2 M) in the purification buffers to reduce the binding of contaminants as a result of nonspecific ionic interactions.
Add ß-mercaptoethanol (up to 20 mM) to the lysis buffer to prevent copurification of host proteins that may have formed disulfide bonds with the protein of interest during cell lysis.
Add detergents such as Triton X-100 and Tween 20 (up to 2%), or additives such as glycerol (up to 50%) or ethanol (up to 20%) to reduce nonspecific binding to the matrix due to nonspecific hydrophobic interactions.
Reduce the amount of Ni-NTA matrix. Low-affinity binding of background proteins will be reduced by matching the total binding capacity of Ni-NTA matrix with the expected amount of 6xHis-tagged protein.

FAQ ID -102