アッセイおよび検出用酵素

T7 DNAポリメラーゼはそれ自体、プロセシビティが低く、15 nt未満の取り込みで、プライマー–テンプレートから解離します。E. coliに感染すると、T7ファージは、宿主タンパク質であるチオレドキシンを付加し、プロセシビティ因子として機能させます。T7 DNAポリメラーゼとチオレドキシンは1対1で結合して複合体を形成します。チオレドキシンがT7 DNAポリメラーゼに結合すると、プライマー–テンプレートに対するポリメラーゼの親和性が80倍も特異的に増加します。プライマー–テンプレートに対する親和性が高くなると、T7 DNAポリメラーゼは一本鎖DNA上のプライマーを解離することなく数千ヌクレオチド伸長することができ、長いDNAの連続合成が可能になります。T7 DNAポリメラーゼを使用して、残りのゲノムDNAを除去して共有結合で閉じた環状DNAを精製し、相補的なcDNA鎖を合成することができます。 

さらなるアプリケーションは、二本鎖DNAに存在するニックをラベリングすることによるアポトーシス断片化DNAのin situ検出です。高いプロセシビティ、強力な3’→5’エキソヌクレアーゼ活性、さまざまなタグ付きヌクレオシド三リン酸に対する耐性は、DNA損傷のin situラベリングに対するT7 DNAポリメラーゼのアプリケーションに最も重要な特性です。

in vivoコメットアッセイは、OECDの試験ガイドラインに沿って確立された遺伝毒性試験です。標準的な方法では、DNA損傷を鎖切断とアルカリ不安定部位として検出します。このアッセイのDNAを損傷特異的酵素とともにインキュベートする追加ステップを含めると、DNA損傷の特異的性質について重要な情報を得ることができます。

修復アッセイのほとんどのアプリケーションは、ヒトのバイオモニタリングにあります。日々、ヒトの集団は、職業的および環境的に、変異原性化合物や発がん性化合物に曝露されています。職業的な曝露について言えば、いくつかの仕事で、遺伝毒性/変異原性化合物への曝露が起きています。たとえば、殺虫剤、染毛剤、ホルムアルデヒド、抗腫瘍薬、有機溶媒などの使用です。

コメットアッセイ技法は、単一核様体（細胞溶解およびヒストン除去後に核マトリックスに付着したDNA）の電気泳動に基づいており、スーパーコイルを緩めて切断を含むDNAループの移動を可能にする切断の頻度に応じて、テールの強度を持つ彗星様の画像が得られます。核様体を病変特異的エンドヌクレアーゼで消化することにより、さまざまなDNA損傷が検出できます。

E. coli由来のエンドヌクレアーゼVIII（Endo VIII）は、チミンの放射線分解産物であるチミングリコールなどの酸化的に損傷した広範囲のピリミジン塩基や尿素を除去する役割を担っています。この酵素をコメットアッセイに使用し、このクラスのDNA損傷を示します。Endo VIIIは塩基除去修復（BER）経路で作用し、N-グリコシド結合の加水分解を触媒します（N-グリコシラーゼ活性）。その結果、修飾された遊離塩基とアプリン/アプリミジン（AP）部位が形成されます。その後、AP部位の開裂がβ, δ-除去（AP-リアーゼ活性）を介して進行し、一本鎖DNA切断が生じます。本アッセイではこの切断を検出し、損傷を特定します。

Endo VIIIのDNase Iフットプリント解析では、DNAに結合するタンパク質が、主に損傷を受けた鎖に接触部位を持つ小さなフットプリントとして示されます。