dPCR CNV Probe Assays

• 200개 이상의 표적에 대한 웨트 벤치(wet-bench) 검증으로 뛰어난 성능을 보장하는 분석 항목(assays)
• 염료 선택을 통해 반응당 최대 5개 타깃까지 멀티플렉싱 가능
• 관심 유전자, 참조 및 중심체(centromeric) 참조 분석 사용 가능
• FFPE, 세포주 및 gDNA와 같은 다양한 검체들에 대해 검증된 즉시 사용 가능한 분석(assays)
• QIAcuity의 간단하고 빠른 dPCR 워크플로우
• QIAcuity Software Suite를 사용한 편리한 복제 수 데이터 분석

dPCR CNV Probe Assays는 개별 유전자 또는 관심 영역에 특이적이고 정확하며 재현성 있고 해석하기 쉬운 복제 수 변이 분석을 가능하게 합니다. 200개 이상의 표적에 대한 분석은 dPCR 웨트 랩(wet-lab) 테스트를 거쳤으며 특정 분석 설명에서 플래그가 표시됩니다.

dPCR CNV Probe Assays는 바로 사용 가능한 20배 농축된 분석 항목이 튜브 형식으로 제공됩니다. 튜브에는 QIAcuity Probe PCR Kit (DNA 표적), QIAcuity Digital PCR System 및 QIAcuity Nanoplate와 함께 사용하기 위한 프라이머 쌍과 가수 분해 프로브가 포함되어 있습니다.

각 분석에 대해 FAM, HEX, ROX, Atto 550 및 Cy5의 5가지 서로 다른 가수 분해 프로브(형광단) 선택을 할 수 있습니다. 이러한 유연성 덕분에 단일 dPCR 반응에서 최대 5개 표적에 대한 멀티플렉스 분석을 위한 assay의 혼합 및 매치가 가능합니다.

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뛰어난 분석 성능

dPCR CNV Probe Assays는 두 가지 다른 gDNA 템플릿 농도를 사용하는 듀플렉스 분석에서 음성 및 양성 분할 클러스터 사이의 우수한 제품 증폭 및 분리를 나타냅니다(KRAS 및 TERT 분석에 대한 듀플렉스 반응의 1D 및 2D scatterplots 참조). 결과는 낮은 농도의 gDNA에서도 CNV의 정확한 분석을 수행할 수 있음을 나타냅니다. 8.5k 나노플레이트에 대한 최소 및 최대 로딩량은 QIAcuity user manual extension을 확인하십시오.

디지털 PCR을 이용한 정확하고 재현 가능한 복제 수 분석

재현성이 높은 QIAcuity dPCR 시스템과 dPCR CNV Probe Assays를 사용하면 반복 없이 CNV를 분석할 수 있어 비용 효율적으로 검체 처리량을 높일 수 있습니다. gDNA 검체의 듀플렉스 분석 결과 모든 반복 검체들에 대해 게놈당 예상한 복제 수를 나타냅니다. (정확하고 재현 가능한 듀플렉스 복제 수 분석 참조). gDNA 희석 시리즈를 분석하는 정밀도 테스트에서 분석(assay)은 우수한 선형 분포 및 클러스터 분리를 나타냅니다(희석 시리즈 정밀성 테스트의 선형 분포 참조).

dPCR을 이용한 멀티플렉스 복제 수 분석

dPCR CNV Probe Assays를 사용한 멀티플렉스 분석은 처리량을 높이고 표적당 분석 비용을 크게 줄입니다. 서로 다른 염료(FAM, HEX, ROX, Atto 550 및 Cy5)로 이러한 분석(assays)을 주문할 수 있으므로 단일 반응에서 동시에 최대 5개 표적까지 유연한 실험 설계 및 멀티플렉스 분석이 가능합니다. dPCR CNV Probe Assays는 단일 반응에서 멀티플렉싱된 5개의 분석에 대해 우수한 증폭 및 양성 및 음성 클러스터 분리를 보여줍니다(5-플렉스 반응에서 CNV 검출 참조).

모든 dPCR CNV Probe Assays는 인간 게놈의 고유한 영역에 대해 설계되었습니다. dPCR CNV Probe Gene of Interest Assay는 활발히 연구된 암 및 암 관련 유전자를 표적으로 합니다. dPCR CNV Probe Reference Assay 및 dPCR CNV Probe Centromeric Reference Assay에는 게놈당 복제 수가 다른 다양한 참조가 포함되어 있어 각 분석에 대해 최적의 정규화(normalization) 참조를 선택할 수 있습니다. 실험 조건에 따라 여러 GOI 및 참조 분석을 반응에 포함하여 관심 표적의 유전자 또는 복제 수를 정확하게 계산할 수 있습니다.

dPCR Copy Number Probe Assay는 바로 사용할 수 있습니다. 개별 분석 혼합물을 DNA 검체에 추가하고 QIAcuity Probe PCR Kit의 Mastermix를 추가하고 QIAcuity Nanoplate에 로드한 후 QIAcuity 기기에서 실행하기만 하면 됩니다. 각 분석은 인간 게놈 전반에 걸친 특이적 유전자 영역의 종말점 PCR 증폭을 기반으로 합니다. 증폭된 생성물은 표적 특이적 형광 가수 분해 프로브를 사용하여 검출되며, 이는 높은 분석 특이성을 보장하는 데 도움이 됩니다.

나노플레이트에서의 dPCR 반응 원리는 여기에 설명되어 있습니다.

실험 설정 절차는 단순하고 간단하며 QIAcuity dPCR 기기를 사용하는 모든 실험실에서 수행할 수 있습니다. 보다 정확한 복제 수 분석을 위해 검체에서 genomic DNA 분리 후 제한 효소로 gDNA 단편화를 수행하는 것이 좋습니다. 고도로 단편화된 DNA(예: FFPE DNA 또는 순환 DNA) 또는 cDNA에는 제한 분해가 필요하지 않습니다. 반응 혼합물에서 직접 제한 분해를 수행하려면 반응 설정 중에 권장 제한 효소를 추가하십시오. 표적 앰플리콘 영역 내를 절단하는 제한 효소를 사용하지 않는 것이 중요합니다.

그런 다음 단편화된 템플릿을 바로 사용할 수 있는 QIAcuity Probe PCR Kit 마스터 믹스 및 dPCR CNV Probe Assays와 혼합하고 이 혼합물을 dPCR pre-plate의 각 웰에 분주합니다. 그런 다음 반응 혼합물을 피펫팅을 통해 잘 혼합하고 QIAcuity Nanoplate의 웰로 옮깁니다. 각 유전자 또는 관심 표적과 각 참조 분석은 서로 다른 형광단을 사용하여 싱글 웰에서 멀티플렉스로 분석할 수 있습니다.

나노플레이트를 밀봉하고 로딩한 후 QIAcuity 기기에서 권장 사이클링 프로그램을 실행합니다. 마이크로리터당 복제 수 결과가 QIAcuity Software Suite의 절대 정량화 분석 유형에 표시됩니다. 유전체당 복제 수를 계산하려면 QIAcuity Software Suite에서 복제 수 데이터 분석 항목 유형을 선택하고 관심 유전자/영역 또는 정규화 기준(normalization reference)에 해당하는 나노플레이트 웰을 정의합니다. 사이클링 프로토콜에 따라 dPCR 실행 결과는 ~2시간 후에 QIAcuity Software Suite에서 분석될 수 있습니다.

dPCR CNV Probe Assays는 신선한, 냉동 또는 고정 검체 DNA를 사용하여 개별 유전자좌(loci)에서 복제 수 변형 또는 변이를 정확하게 검출하는 데 매우 적합합니다.