디지털 PCR을 위한 QuantiNova LNA PCR Custom Assays

• 편리한 설계 도구와 사전 설계된 분석 항목에 사용된 동일한 알고리즘으로 생성된 고성능 분석
• 정확한 표적 및 필요에 맞는 맞춤형 분석 항목(새로운 전사체 또는 특정 동형(isoform) 또는 스플라이스 변이체의 검출 포함)
• 최대 10개의 시퀀스를 제출하고 모든 시퀀스를 구별하거나 검출하기 위한 분석 항목을 설계할 수 있는 기능
• 분석 항목 위치 지정에 있어 높은 특이성과 더 큰 유연성을 제공하는 짧은 LNA 강화 프라이머
• QIAcuity 기기 및 QIAcuity EG PCR Kit를 사용하여 dPCR로 발현 변화의 절대 정량화

QuantiNova LNA PCR Custom Assays는 LNA 강화된 EvaGreen 기반 디지털 PCR을 사용하여 모든 RNA 표적의 정확하고 민감한 유전자 발현 분석을 제공합니다. 당사의 강력한 설계 알고리즘은 인간, 마우스 및 래트 표적에 대한 완전한 Ensembl 데이터베이스 지원을 제공하고 분석 항목 생성을 간소화합니다. 맞춤형 분석 항목은 사전 설계된 분석을 사용할 수 없는 표적, 스플라이스 변이체 식별 및 새로운 mRNA 또는 lncRNA 확인에 적합합니다. 디지털 PCR의 경우 분석 항목들을 QIAcuity EG PCR Kit 및 QIAcuity 기기에 최적화했으며, 단 2시간 내에 가능한 간단하고 빠른 절대 정량 워크플로우를 만들었습니다.

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QIAcuity EG PCR Kit 및 QIAcuity 기기를 사용한 최적화된 디지털 PCR 분석

QuantiNova LNA PCR Assays는 높은 특이성의 표적 증폭을 제공하기 위해 개발되었습니다. 이는 표준 실시간 서머사이클러를 사용한 qPCR과 QIAcuity 기기와 QIAcuity EG PCR Kit 를 사용한 디지털 PCR의 두 가지 PCR 방법으로 정량화할 수 있습니다(디지털 PCR을 위한 QuantiNova LNA PCR Assays 사용 그림 참조). QuantiTect Reverse Transcription Kit를 사용하여 cDNA 합성 후, 디지털 PCR은 매우 정밀한 표적 정량화를 제공하여 최저 농도에서 가장 작은 발현 변화까지도 검출합니다. 주요 분석 항목의 하위 집합은 QIAcuity 기기에서 실험적으로 검증되었습니다.

고감도 및 특정 LNA 강화 분석 항목

QuantiNova LNA PCR Custom Assays는 신뢰성 있고 정확한 유전자 발현 분석 결과를 위한 최고의 특이성과 효율성을 제공하기 위해 엄격한 설계 기준과 실험실에서 검증된 알고리즘을 사용하여 생성됩니다.

LNA 염기의 높은 결합 친화도는 전사체에서 프라이머 배치의 유연성을 증가시키므로 지능형 위치 지정을 사용하여 다른 방법으로는 분석하기 어려운 표적에 대한 분석 항목을 설계할 수 있습니다. 이를 통해 AU가 풍부한 표적, 함량이 낮은 전사체, 2차 구조가 높은 표적 및 고도로 복잡한 샘플의 경우에도 더 나은 표적 식별 및 강력하고 신뢰성 있는 정량화를 제공합니다.

높은 민감도를 가진 분석 항목은’ 1개 RNA 분자까지 우수한 증폭 효율을 보장하므로 시작 물질이 적은 lncRNA와 같이 낮은 함량의 표적을 더 쉽게 검출할 수 있습니다. LNA의 정교한 배치로 인해 증가된 특이성은 높은 신호 대 잡음비를 제공하여 단 하나의 뉴클레오티드만 다른 서열을 식별할 수 있으며 비특이적 증폭 및 프라이머-이합체(dimer) 형성을 제거합니다.

정교한 LNA 설계 알고리즘을 사용하여 생성

20년의 LNA 설계 경험을 통해 당사는 정교한 LNA 설계 알고리즘을 개발하고 최적화할 수 있었습니다. 이 알고리즘은 성공적인 표적 검출을 위한 가장 최적의 분석 항목을 보장하기 위해 매우 엄격한 성능 기준에 대해 실험실에서 철저히 검증된 50개 이상의 다양한 매개변수를 통합합니다. 이 독점 알고리즘은 130만 개 이상의 분석 항목을 설계하는 데 사용되었으며 GeneGlobe의 편리한 맞춤형 분석 항목 빌더를 통해 귀하의 전문적인 요청에도 사용할 수 있습니다.

EvaGreen 기반 디지털 PCR

dPCR에 의한 절대 정량화를 위해, EvaGreen 기반 형광 검출을 사용하는 QIAcuity EG PCR Kit와 함께 QuantiNova LNA PCR Assays를 사용하십시오. EvaGreen은 이중 가닥 DNA(SYBR^® Green과 유사)에 결합하고 DNA 결합 시 형광을 발하는 삽입 염료입니다. EvaGreen 기반의 dPCR을 사용하면 증폭 및 검출을 위한 프라이머 세트만 있으면 되기 때문에 편리하고 경제적입니다. 또한 수천 개의 dPCR 나노플레이트 분획으로 분할된 dPCR 반응에서 더 높은 분리도를 제공하므로 dPCR 반응에 필요한 프라이머 농도는 qPCR에 필요한 프라이머 농도의 절반에 불과합니다.

맞춤형 설계 프로세스

QuantiNova LNA PCR Custom Assay 설계 도구를 사용하면 사전 설계된 분석으로 제공되지 않는, mRNA 또는 lncRNA에 대해 매우 민감하고 특정적인 LNA 강화 PCR 분석을 쉽게 설계할 수 있습니다. 향상된 QuantiNova PCR Assay 설계 알고리즘을 사용하여 50개 이상의 다양한 기준을 기반으로 수많은 분석 조합을 평가하여 수분 안에 표적에 대한 최적의 분석을 찾아냅니다. 이 도구는 Ensembl 및 RefSeq를 포함한 종 관련 데이터베이스에 대해 최소 55개 뉴클레오티드 및 모세포의 인간, 마우스 및 래트 mRNA 및 lncRNA 표적을 위해 설계되었습니다. 알려진 유전자 표적의 경우, 사전 설계된 분석 항목과 유사하게 기본적으로 분석 항목은 인트론 스패닝으로 설계되어 gDNA 증폭의 위험을 방지합니다.

고유한 고급 분석 항목 설계 옵션

맞춤형 분석 항목 설계 도구에는 스플라이스 변이체, SNP 또는 동형(isoform)을 구별하기 위한 전사체별 설계를 생성하는 옵션이 포함되어 있습니다. 또는, 모든 전사체 변형에 공통적인 분석 항목을 위한 설계도 생성할 수 있습니다. 한 번에 최대 10개의 서로 다른 표적 서열을 제출하고 10개의 상이한 분석 항목을 설계하거나 관련 전사체에 모두에 대한 공통 분석 항목을 설계할 수 있습니다.

Reference Gene Assays는 맞춤형 분석과 쉽게 결합할 수 있습니다.

기능적으로 검증된 다양한 인간, 마우스 및 래트 Reference Gene Assays는 고품질 데이터 정규화(normalization)를 가능하게 하고 신뢰할 수 있는 결과를 보장하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 분석 항목은 일반적으로 다양한 조직에서 구성적으로 발현되는 내인성 코딩 RNA, 긴 비코딩 RNA(lncRNA) 및 소형 핵소체 RNA(snRNA) 분자를 표적으로 합니다.

mRNA/lncRNA qPCR 결과 정규화(normalization)

정규화는 조사 중인 생물학적 변화와 관련 없는 기술적 및 생물학적 샘플 간 변이를 제거합니다. 적절한 정규화는 결과의 정확한 분석 및 해석에 매우 중요합니다. 가장 일반적으로, 안정적으로 발현되는 기준 유전자가 정규화에 사용됩니다.

일반적으로 실제 mRNA/lncRNA 발현 분석을 설정하기 전에 여러 내인성 대조 기준 유전자 후보들에 대한 테스트가 권장됩니다. 이러한 후보는 연구 중인 전체 샘플 범위에 걸쳐 안정적으로 발현될 것으로 예상되는 유전자로부터 선택해야 합니다. 이 후보들은 문헌 또는 기존 데이터(예: NGS 또는 qPCR 패널 스크리닝)를 기반으로 안정적으로 발현되는 mRNA 또는 lncRNA를 선택할 수 있습니다. QuantiNova LNA PCR 시스템은 안정적으로 발현되는 경향이 있어 기준 유전자로 적합한 후보인 RNA에 대해 검증된 기준 유전자(reference gene) 분석 항목을 제공합니다.

모든 기준 유전자 후보는 각 연구에 대해 실험적으로 검증되어야 합니다. 다수의 mRNA/lncRNA를 프로파일링할 때 PCR 패널을 정규화(normalizing)하는 한 가지 옵션은 전체 평균(발현된 모든 mRNA/lncRNA의 평균)에 대해 정규화하는 것입니다. 이는 높은 call rate(발현된 유전자)을 가진 샘플에는 좋은 옵션이 될 수 있지만 낮은 call rate를 가진 샘플에서는 주의해서 사용해야 합니다. 또한 일반적인 유전자 발현 수준이 변경된 샘플에서는 좋은 옵션이 아닙니다. 또한 정규화(normalization)에 대한 추가 지침은 GeneGlobe 데이터 분석 센터에서 찾아볼 수 있습니다.

디지털 PCR 데이터 분석

QIAcuity Software Suite는 dPCR 데이터 분석에 사용하며 유전자 발현 테스트가 포함되어 있어 출판 가능한 수치가 포함된 배수 변화 및 배수 조절로 결과를 제공합니다.

Two-step RT-dPCR

QuantiTect Reverse Transcription Kit(카탈로그 번호 205311, 205313, 205314)를 사용하여 역전사 반응을 수행할 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. QuantiNova Reverse Transcription Kit 사용은 권장되지 않습니다. 생성된 cDNA는 사용자가 선택한 QuantiNova LNA PCR Assay와 QIAcuity EG PCR Kit 마스터 믹스를 사용하여 dPCR로 정량합니다.

중요한 참고 사항: 분석 항목 제품명 뒤에 괄호 안에 표시된 반응량은 qPCR 사용에 해당됩니다. 디지털 PCR은 프라이머 농도의 절반만 필요하지만 반응물 부피는 다릅니다. QIAcuity Nanoplate 26K를 사용하면 표시된 바와 동일한 수의 반응을 설정할 수 있습니다. Nanoplate 8.5K를 사용하면 3.3배 더 많이 설정할 수 있습니다. dPCR 지침은 QIAcuity 사용 안내서를 참조하십시오.

배송 및 인도

QuantiNova LNA PCR Assays는 상온으로 배송됩니다. 재고가 있는 분석 항목은 1–5일 이내에 배송됩니다. 초기 이용 기간 동안에는 배송 시간이 더 길어질 것으로 예상됩니다.

QuantiNova LNA PCR 시스템으로 디지털 PCR을 시작하는 데 필요한 물품

역전사: QuantiTect Reverse Transcription Kit(카탈로그 번호 205311, 205313, 205314)

dPCR 마스터 믹스: QIAcuity EG PCR Kit

분석 항목:

QuantiNova LNA PCR Custom Assays는 다음과 같은 애플리케이션에 매우 적합합니다.

• mRNA 및 lncRNA 발현 분석, 프로파일링 및 정량화
• RNA-seq 유전자 발현 데이터 검증
• 유전자 발현 프로파일링
• 신호 및 경로 분석
• LNA GapmeR 또는 siRNA에 의한 유전자 발현 녹다운(knockdown) 확인
• 질병 관련 바이오마커의 스크리닝, 식별 및 검증을 포함한 바이오마커 개발
• 유전자 발현과 관련된 표현형 변화 모니터링

또한 여러 QuantiNova LNA PCR Assays를 사용하여 집중된 유전자 패널을 검사할 수 있습니다.