RNA 분석을 위한 효소 | 역전사 효소 및 RNA 리가아제

RNA의 모든 것: 증폭, 염기서열 분석, 연결, 라벨

유전자 발현의 다운스트림 분석을 위해 RNA를 조작하는 데 사용할 수 있는 효소 제품군이 있습니다. 역전사 효소는 전사체로부터 상보적 DNA(cDNA)를 생성합니다. cDNA는 클로닝이나 정량적 연구를 위해 라벨링하거나 증폭시킬 수 있습니다. RNA 리가아제는 염기, 라벨, 어댑터를 결합하고, RNA 중합효소는 리보뉴클레오티드를 추가하며, 리보핵산분해효소는 리보뉴클레오티드를 제거합니다.

증폭을 통한 RNA 검출 및 조작

역전사 효소 는 원래의 RNA 템플릿에 상보적인 DNA 한 가닥(cDNA)을 중합할 수 있는 효소입니다. RNA는 RNAase에 의해 쉽게 분해되므로 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 생성하면 mRNA로 작업할 때의 문제를 극복할 수 있습니다. cDNA는 유전자 발현 분석과 같은 RNA 연구를 위한 다양한 다운스트림 응용에서 안정적인 템플릿이 됩니다. cDNA 템플릿의 증폭에는 일반 PCR, qPCR, one-step RT-qPCR 또는 등온법을 사용할 수 있습니다. 증폭 산물은 기존 효소 프로토콜을 사용한 클로닝 또는 T4 DNA polymerase의 3’→5’ 엑소뉴클레아제 활성을 활용한 독립적인 라이게이션 클로닝을 수행할 수 있습니다.

모든 역전사 효소(RNA 의존성 DNA 중합효소)는 다음에 사용할 수 있습니다.

cDNA 합성

첫 번째 가닥 cDNA 합성
클로닝을 위한 이중 가닥 cDNA 합성

올리고(dT)로 프라이밍된 mRNA의 RT는 3' 말단에 고리가 있는 첫 번째 가닥 cDNA 생성. mRNA를 제거하면 역전사 효소에 의해 cDNA의 두 번째 가닥 합성을 위한 프라이머로 사용할 수 있는 3' 고리가 있는 단일 가닥 cDNA 분자가 남습니다.

cDNA 증폭

역전사(RT) 및 RT-PCR
정량적, real-time RT-PCR

RT 시, 분리된 mRNA는 역전사 효소와 유전자 특이적 프라이머, 랜덤 올리고머 또는 올리고(dT)에 의해 cDNA로 변환됩니다. RT-PCR은 RT로 시작하여 PCR 증폭을 위해 cDNA를 사용합니다. RT-qPCR은 PCR 증폭과 검출 및 정량화가 하나의 분석 안에 결합 되어 있습니다.

mRNA 분석

프라이머 연장
cDNA 라벨링

프라이머 연장 시, 유전자의 전사 시작부는 중간 cDNA 생성물 분석을 통해 인코딩된 mRNA 5' 말단을 식별하여 결정됩니다. 다이렉트 cDNA 라벨링 프로토콜은 RT 반응 동안 통합된 변형 dNTP를 사용합니다.

		RNase H(+/-)	전문적인 응용
P7600L EnzScript	출시 예정	마이너스	전장 cDNA 비율이 높고 긴 cDNA 및 라이브러리용; 템플릿 전환이 필요한 응용, 즉, RNA-Seq
P7720L StableScript	출시 예정	마이너스	긴 cDNA용; 향상된 진행도(processivity), 억제제 내성, 열 안정성 (최적 온도 55°C)
205111 Omniscript Kit		플러스	마이크로어레이용 라벨링; 모든 양의 RNA를 역전사할 수 있도록 특수 설계, 최적화된 완충액, RNase H 단계 필요 없음

RNA 중합효소 및 리가아제

RNA 중합효소, 또는 더 구체적으로 DNA-directed RNA 중합효소는 DNA 템플릿에서 RNA를 합성하는 효소입니다. Poly(A) 중합효소는 단일 가닥 RNA를 프라이머로 사용하여 아데닌 잔기를 RNA의 3’ 종단점에 결합시키는 촉매 작용을 통해 RNA에 poly(A) 꼬리를 추가합니다.

T4 RNA 리가아제는 특히 고처리량 RNA 염기서열 분석 및 마이크로어레이와 같은 절차의 업스트림에서 RNA 분석에 유용한 효소입니다. T4 RNA ligase 1과 2는 인접한 3'-OH 및 5'-PO4 폴리뉴클레오타이드를 결합하여 RNA의 라벨링, 원형화 또는 분자 간 연결을 수행할 수 있는 효소입니다. T4 RNA ligase 1로 RNA 3' 말단에 어댑터를 부착하는 것은 RT-PCR 및 고처리량 염기서열 분석을 통한 RNA 정량화 및 발견에 유용한 첫 단계입니다.

		작용	응용
P7180L T7 RNA Polymerase	출시 예정	DNA 템플릿에서 5’→ 3’ 방향으로 RNA를 합성; T7 프로모터에 특이적	체외 mRNA 합성 RNA 프로브 라벨링 RNA 연구를 위한 RNA 생성 안티센스 RNA를 통한 발현 제어 sgRNA 합성
P7460L Poly(A) Polymerase	출시 예정	Poly(A) 꼬리 RNA를 위해 ATP에서 RNA의 3’-OH로 AMP를 추가하는 것을 촉매	ATP 또는 코디세핀으로 RNA에 3' 라벨링 RNA poly(A) 테일링 Poly(A) 꼬리는 진핵세포로 전달되는 RNA의 번역을 향상시킴
L6050L T4 RNA Ligase 1	출시 예정	단일 가닥 RNA 리가아제, 단일 가닥 DNA 분자와도 결합	단일 가닥 RNA 또는 DNA 연결 단일 가닥 RNA 또는 DNA의 3' 말단 라벨링
L6080L T4 RNA Ligase 2	출시 예정	dsRNA에서 틈(nick) 연결; 이중 가닥 혼성체에서 RNA의 3’-OH를 DNA의 5’-PO4에 연결 가능	다중 올리고뉴클레오티드의 템플릿 결합 부위 특이적 변형 또는 라벨이 포함된 RNA 합성 dsRNA의 틈(nick) 연결 DNA/RNA 듀플렉스에서 RNA의 3’-OH와 DNA의 5’-PO₄ 연결
L6070L T4 RNA Ligase 2 (Truncated, )	출시 예정	사전 아데닐화된 5’ 인산염(DNA 또는 RNA)과 RNA의 3’ 수산기 사이의 인산다이에스터 결합 형성을 촉매	사전 아데닐화된 5’ DNA로부터 3’ 수산기 RNA로 링커 연결 소분자 RNA의 클로닝 및 염기서열 분석

RNA 분해 및 RNA 보호

리보핵산분해효소 보호 분석(RPA)은 효소 RNase A를 사용하여 상대적 또는 절대적 전사체 존재비(abundance)를 결정하고 mRNA 종단점 및 인트론/엑손 경계를 매핑하는 데 사용되는 기술입니다.

단일 염기 치환은 RNA:DNA heteroduplexes 의 단일 염기 불일치에 대한 RNase A 절단과 관련된 간단한 효소법으로 검출 및 위치 확인이 가능합니다.

		작용	응용
19101 RNase A		C와 U 잔기에서 ssRNA를 분해하는 리보핵산내부분해효소*	상대적 또는 절대적 전사체 존재비(abundance) 결정 mRNA 종단점 및 인트론/엑손 경계 매핑(RPA) DNA 또는 RNA의 단일 염기 돌연변이 매핑 플라스미드 및 유전체 DNA 조제물에서 RNA를 제거함 재조합 단백질 조제물에서 RNA를 제거함
Y9220L RNase H	출시 예정	DNA에 혼성화된 RNA의 인산다이에스터 결합을 가수분해하는 리보핵산내부분해효소	RNase H 작용으로 DNA:RNA 복합체의 RNA 템플릿을 분해하여 두 번째 가닥 cDNA의 합성을 위한 템플릿으로 사용될 단일 가닥 cDNA를 풀어줌
Y9240L RNase Inhibitor	출시 예정	돼지 유래 비경쟁적 RNase A, B, C 억제제; RNase H 활성을 억제하지 않음.	RNA 분해 방지; 흔히 RNA 효소 조작 시 예방적 조치로 사용

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RNA 분석에 대한 FAQ

RNA 의존성 DNA 중합효소라고도 하는 역전사 효소(RT)는 단일 가닥 RNA를 DNA로 전사하는 DNA 중합효소입니다. 레트로바이러스 RT는 세 가지 순차적인 생화학적 활성을 갖습니다. RNA 의존성 DNA 중합효소 활성, 리보핵산분해효소 H(RNase H), DNA 의존성 DNA 중합효소 활성입니다. 종합적으로, 이러한 활성은 효소가 단일 가닥 RNA를 이중 가닥 cDNA로 변환하게 합니다. HIV와 B형 간염 같은 바이러스는 역전사 효소를 사용해 유전체를 복제합니다. 또한 역전사 효소는 레트로트랜스포존 이동성 유전 인자가 숙주 유전체 내에서 증식하고 진핵세포가 선형 염색체 말단에 있는 텔로미어를 연장하는 데도 사용됩니다.

분자 생물학에서 역전사 효소는 증폭 과정을 통해 RNA 분자를 검출하고 조작하는 데 사용됩니다. 새로운 합성의 시작점은 프라이머라고 하는 짧은 DNA 올리고뉴클레오티드로 이것이 RNA 템플릿에 결합합니다. 역전사 효소는 원래의 RNA 템플릿에 상보적인 DNA 가닥, 즉 cDNA를 중합합니다. 그 후 cDNA는 PCR, 정량적 PCR 또는 등온법을 통해 더욱 증폭됩니다.

RNA 중합효소는 국소적으로 이중 가닥 DNA를 열어 노출된 뉴클레오티드 한 가닥이 RNA 합성을 위한 템플릿으로 사용될 수 있게 합니다. 이 과정이 바로 전사입니다. DNA 복제 시, DNA 헬리케이스가 DNA 이중 나선의 두 가닥을 분리하여 복제 분기점이라는 구조를 형성해 두 개의 단일 가닥을 노출시킵니다. 그 후 복제 DNA 중합효소가 각 가닥을 템플릿으로 사용하여 일치하는 새로운 DNA 가닥을 만듭니다. DNA 전사 시 RNA 중합효소는 DNA를 느슨하게 풀고 pre-mRNA를 합성하는 역할을 합니다.

Primase(프라이메이스)는 DNA 복제에 필수적인 역할을 하는 DNA 의존성 RNA 중합효소입니다. 원점에서 헬리케이스에 의해 모체 DNA가 풀린 후, 프라이메이스가 복제 DNA 중합효소에 의해 디옥시뉴클레오티드로 연장된 짧은 RNA 프라이머를 각 템플릿 가닥에 조립합니다. 진핵생물의 DNA에서 mRNA를 합성하는 효소인 RNA 중합효소 II는 합성 시작 시 프라이머가 필요하지 않습니다. 프라이머 필요성은 바이러스의 RNA 의존성 RNA 중합효소마다 다릅니다. 역전사 효소는 tRNA 프라이머가 필요합니다.

진핵세포에는 다른 종류의 유전자를 전사하는 세 가지 RNA 중합효소가 있습니다. 단백질 코딩 유전자는 RNA 중합효소 II에 의해 전사되고, RNA 중합효소 I과 III은 리보솜 RNA(rRNA)와 전달 RNA(tRNA)를 전사합니다. 미토콘드리아 유전체의 전사는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소와는 관계가 거의 없는 RNA 중합효소에 의해 이루어집니다.

Poly(A) 중합효소, 또는 폴리뉴클레오티드아데닐릴전달효소는 단일 가닥 RNA를 프라이머로 사용하여 아데닌 잔기를 RNA의 3’ 종단점에 결합하고 Poly(A) 중합효소 꼬리를 RNA에 효과적으로 추가하는 촉매로 작용합니다. Poly(A) 중합효소는 템플릿 독립적인 중합효소로 말단데옥시뉴클레오티드전달효소(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)를 포함하는 패밀리 X 내 뉴클레오티드전달효소의 큰 상과에 속합니다.

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