Enzymes, NGS, Black male scientist looking at test-tube filled with substance in a laboratory setting
분자 생물학용 효소

PCR 및 DNA 증폭

Taq 처리에는 고온이 필요하며 일부 Taq은 초기부터 고온이 요구됩니다

대부분의 체외 증폭 응용은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 열 안정성 중합효소를 사용합니다. 가장 많이 사용되는 PCR 효소는 Taq DNA 중합효소입니다. Taq DNA 중합효소는 70°C 이상의 온도에서 자라는 극호열성 유박테륨인 Thermus aquaticus에서 추출합니다. 이는 Taq DNA 중합효소의 최적 효소 활성이 약 72°C에서 발현된다는 뜻입니다. 

일반 PCR과 hot-start 중 어느 것을 선택해야 하나요?

일반 Taq 중합효소는 72°C에서 최적 활성을 나타내지만 37°C부터 활성화되기 시작합니다. 저온 활성은 상당히 많으며 PCR 반응 초기 저온 단계 동안 비특이적 증폭과 프라이밍 오류(mis-priming) 현상이 발생할 수 있다는 단점이 있습니다. PCR 자동화가 필요한 경우, hot-start Taq 중합효소 사용을 고려하십시오.

Hot-start 중합효소는 일반 Taq과 다르게 상온에서는 활성화되지 않습니다. Hot-start PCR 기술은 기존 PCR과 같은 원리이지만 첫 번째 변성 단계가 완료될 때까지 효소 활성이 억제됩니다. 이렇게 하면 비특이적 결합과 프라이밍 오류가 최소화되고 특이성이 향상됩니다. 또한 이 기술은 실온에서 반응을 설정할 수 있는 상당한 편의성을 제공하여 PCR 자동화를 가능하게 합니다. 어떤 경우에는 비특이적 증폭이 특정 표적 증폭에 필요한 반응 성분을 고갈시키기 때문에 민감도조차 향상됩니다

모든 Taq 중합효소는 다음에 적합합니다.

3’-A 오버행(overhang)으로 TA 클로닝
3’-A 오버행(overhang)으로 TA 클로닝
Taq은 dsDNA의 3' 말단에 단일 A를 추가한 후 PCR 산물을 상보적인 3′-T 오버행(overhang)이 있는 벡터와 혼합합니다.
단일 콜로니 PCR
단일 콜로니 PCR
박테리아를 용해한 다음 삽입(insert) 특정 또는 벡터 특정 프라이머로 증폭하여 PCR로 DNA 삽입을 신속하게 스크리닝합니다.
유전형 분석
유전형 분석
PCR에 의한 유전형 분석은 돌연변이를 특이적으로 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 유기체(예: WT 또는 돌연변이체)의 유전자형을 결정합니다.
변형 뉴클레오티드를 사용한 PCR
변형 뉴클레오티드를 사용한 PCR
dNTP, ddNTP, dUTP, 이노신, 비오틴-11-dUTP, DIG-11-dUTP, 형광-dNTP/ddNTP가 기질에 포함됩니다.
표준 PCR 또는 자동화 및 고처리량 PCR 응용 분야에 적합한 hot-start 효소에 대한 요구 사항에 따라 Taq DNA 중합효소를 선택하십시오.
효소   특성 제공 품목

  Hot-start
(95°C에서 x분)		 앰플리콘 크기 연장 비율 5’-3’
exonuclease(엑소뉴클레아제)		 PCR buffer(완충액) Loading buffer(로딩 완충액)
P7250L
Taq-B (Taq)
 출시 예정 ✘ 아니요 <5kb
 72°C에서
2–4kb/분
 ✔ 예 ✘ 아니요 ✘ 아니요
P7620L
TaqIT *(Stoffel)
 출시 예정 ✘ 아니요 <7kb 72°C에서
2–4kb/분		 ✘ 아니요* ✔ 예 ✘ 아니요
201203
Taq
   ✘ 아니요 <7kb 72°C에서
2–4kb/분		 ✔ 예 ✔ 예 + Q‑Solution ✔ 예
201223
Taq PCR Core Kit
   ✘ 아니요 <7kb
 72°C에서
2–4kb/분 		 ✔ 예  ✔ 예 + dNTPs ✔ 예
203123
AllTaq PCR Core Kit
   ✔ 예(2분) <9kb 68°C에서
1분/kb		 ✔ 예 ✔ 예 + dNTPs ✔ 예
203203
HotStarTaq		   ✔ 예(15분) <7kb 72°C에서
2–4kb/분		 ✔ 예 ✔ 예 + Q‑Solution ✘ 아니요
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PCR용 효소와 DNA 증폭에 대한 FAQ

PCR을 할 때, 왜 Taq 중합효소를 사용하나요?

Taq DNA 중합효소는 박테리아 복구 중합효소와 대부분의 박테리오파지 복제 중합효소로 구성된 관련 효소 그룹인 패밀리 A에 속합니다. 패밀리 A 중합효소는 일반적으로 복제 및 복구 활성을 모두 갖고 있습니다. 3’→5’ 엑소뉴클레아제 활성에 의해 잘못 짝지어진 뉴클레오티드를 복구하는 중요한 “프루프리딩” 기능이 제공되며, 5’→3’ 엑소뉴클레아제 활성은 RNA 프라이머를 제거합니다. Taq 중합효소에서 3’→5’ 엑소뉴클레아제 프루프리딩 도메인이 변경되어 작동하지 않습니다.

PCR은 세포가 복제 시스템에 요구하는 것과 동일한 기본 요구 사항인 신뢰성, 정밀도 또는 정확성, 속도 및 진행도(processivity)를 중합효소에 요구합니다. 중합효소의 정밀도 또는 정확성이란 템플릿 가닥에 의해 정해진 대로 정확한 뉴클레오티드를 결합하는 것을 의미합니다. DNA 중합효소는 뉴클레오티드 결합 부위에서 일련의 분자 점검 지점을 사용하여 정확한 복제를 보장합니다. 일반 Taq 중합효소는 오류율이 비교적 낮아 매우 정확하지만, 3’→5’ 엑소뉴클레아제 “프루프리딩” 활성이 부족하여 효소의 유효 가능 앰플리콘 크기가 제한적입니다. Taq은 2kb 미만 DNA 단편을 증폭할 때 최고의 성능을 발휘하며, 강력하고 쉽게 최적화할 수 있는 효소입니다. 이 효소는 최대 3–4kb 단편에서 작용할 수 있지만 약 3kb보다 긴 앰플리콘에서는 효율이 빠르게 떨어집니다.

Hot-start PCR에서 Taq DNA 중합효소의 변형은 어떻게 이루어지나요?

Hot-start PCR은 더 높은 온도에 도달할 때까지 효소를 비활성 상태로 만들어 증폭을 차단하는 DNA 중합효소 변형을 통해 이루어집니다. 일반적인 변형체에는 항체 상호작용, 화학적 변형, 압타머 기술이 있습니다. PCR 사이클링 중에 허용 반응 온도에 도달하면 억제제가 중합효소에서 해리되고 중합반응이 시작됩니다.

효소 결합 항 Taq DNA 중합효소 항체는 중합효소에 결합 및 부착하여 효소를 불활화하여 낮은 온도에서 조기 DNA 증폭을 방지합니다. 최적의 어닐링 온도에 도달하면, 항체가 분해 및 해리되기 시작하고 Taq DNA 중합효소가 반응을 일으키도록 방출하여 증폭 과정이 시작됩니다.

화학적으로 변형된 Taq DNA 중합효소에는 특정 아미노산 잔기에 열에 취약한 차단 그룹이 부착되어 있습니다. 이들은 PCR 반응 초기 고온 활성 단계에서 제거됩니다. 이렇게 하면 Taq DNA 중합효소가 최대 활성으로 복원되고 PCR 사이클링을 진행할 수 있습니다.
압타머 매개 hot-start PCR은 올리고뉴클레오티드 압타머 부착을 통해 Taq DNA 중합효소 기능을 억제하는 데 기반합니다. 압타머는 열에 약한 화학적 차단 그룹이나 항체보다 낮은 온도에서 효소로부터 해리되므로 고온 활성 단계가 필요 없이 PCR 프로토콜을 가속할 수 있습니다. 또한 압타머 기반 억제는 완전히 가역적이므로 열 순환이 끝날 때 Taq DNA 중합효소 활성 역시 차단됩니다.
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