디지털 PCR을 위한 miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays

• 모든 miRNA를 위한 LNA 강화 디지털 PCR 프라이머 세트 직접 설계
• 타의 추종을 불허하는 민감도로 단 1pg의 총 RNA에서 miRNA 정량화 가능
• 높은 특이성은 전구체(precursors)에서 밀접하게 관련된 miRNA 및 mature miRNA를 구별함
• 빠르고 간단한 2단계 dPCR 프로토콜로 3시간 미만 소요
• QIAcuity 기기 및 QIAcuity EG PCR Kit를 사용하여 dPCR로 miRNA 발현 변화의 절대 정량화

miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays는 맞춤 설계된 miRNA PCR 프라이머 세트로 매우 민감하고 특이적인 miRNA 정량화를 가능하게 합니다. 정방향 및 역방향 PCR 증폭 프라이머는 모두 miRNA 특이적이며 LNA 기술로 최적화되어 있습니다. 분석은 튜브 형식으로 제공되며 Nanoplate 8.5k(반응당 12μl)에서 166 reaction 또는 Nanoplate 26k(반응당 40μl)에서 50 reaction에 충분한 프라이머를 포함합니다. 업스트림 cDNA 합성 단계는 miRCURY LNA RT Kit로 수행되고 디지털 PCR 증폭은 QIAcuity EG PCR Kit를 사용하여 QIAcuity 기기에서 수행됩니다.

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QIAcuity EG PCR Kit 및 QIAcuity 기기를 사용한 최적화된 디지털 PCR 분석

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 표적 증폭의 높은 특이성을 제공하기 위해 개발되었습니다. 이는 표준 실시간 서머사이클러를 사용한 qPCR과 QIAcuity 기기와 QIAcuity EG PCR Kit를 사용한 디지털 PCR의 두 가지 PCR 방법으로 정량화할 수 있습니다. miRCURY LNA RT Kit를 사용하여 cDNA 합성 후, 디지털 PCR을 이용한 표적 정량화는 매우 정밀한 결과를 제공하며 최저 농도에서 가장 작은 발현 변화까지도 검출합니다. 주요 miRNA의 하위 집합(subset)은 QIAcuity 기기에서 실험적으로 검증되었습니다.

PCR 성능을 향상시키는 LNA

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 엄격한 설계 기준과 검사실에서 검증된 알고리즘을 사용하여 개발되었습니다. 엄격한 분석 항목 선택 프로세스를 통해 각 프라이머 세트가 최고의 특이성과 효율성을 제공하여 가장 신뢰할 수 있고 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. T_m 정규화(normalization) 및 LNA 강화는 프라이머에 표준 DNA 프라이머보다 더 높은 결합 친화도를 제공하여 분석 항목 민감도와 특이성을 극적으로 증가시킵니다.

스템-루프(stem-loop) 또는 표준 DNA 프라이머를 사용하는 다른 miRNA PCR 시스템과 비교하여 LNA 강화 프라이머는 특히 AT가 풍부한 miRNA의 경우 크게 향상된 민감도를 제공합니다

설계 프로세스

miRCURY LNA miRNA Custom PCR Assays 설계 도구를 사용하면 사전 설계된 제품으로 제공되지 않는 miRNA에 대해 매우 민감하고 특이적인 LNA 강화 PCR 프라이머 세트를 쉽게 설계할 수 있습니다. 고급 알고리즘은 60개 이상의 다양한 기준을 기반으로 약 3,000개의 프라이머 쌍(pair) 디자인을 평가하여 몇 분 안에 miRNA에 대한 최적의 LNA 프라이머 세트를 찾습니다. 이 도구는 miRNA용으로 설계되었지만 길이가 14–27 뉴클레오티드인 다른 작은 RNA에도 사용할 수 있습니다.
설계 기준은 다음과 같습니다.

• 높은 증폭 효율과 특이성을 보장하기 위해 프라이머의 LNA 분포를 변화시켜 용융 온도를 최적화합니다.
• 효율적인 PCR 반응을 위한 self-hybridization 및 교차 cross-hybridization 점수 계산 및 조정.
• PCR 반응에서 잠재적인 프라이머–다이머(dimer) 형성을 피하기 위한 조정.
• LNA 올리고뉴클레오티드 설계에 대한 방대한 지식을 바탕으로 프라이머에서 LNA 염기의 지능적 배치.
• miRBase는 서열 유사성이 높은 잠재적인 miRNA를 식별하기 위해 검색합니다. 이는 프라이머 세트가 설계된 작은 RNA에 대해 매우 특이적임을 보장합니다.

miRNA 프로파일링을 위한 고유한 시스템

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 범용 RT와 LNA PCR 증폭을 결합하여 microRNA PCR 시장에서 최고의 성능과 사용 편의성을 제공합니다(그림  miRCURY LNA miRNA 디지털 PCR 시스템의 개략도 참조). 범용 RT를 사용하면 하나의 first-strand cDNA 합성 반응을 여러 miRNA real-time PCR 분석을 위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다. 이는 귀중한 검체를 절약하고 기술적 변동을 줄이며 실험실에서 시간을 절약합니다. 또한 정방향 및 역방향 PCR 증폭 프라이머는 miRNA 특이적이며 LNA로 최적화되어 있습니다. 이는 1) 매우 낮은 miRNA 수준의 정확한 정량화를 가능하게 하는 탁월한 민감도와 매우 낮은 배경 및 2) 밀접하게 관련된 miRNA 서열을 구별할 수 있는 매우 특이적인 분석을 제공합니다.

QIAcuity Nanoplate에서의 dPCR 반응 원리는 여기에 설명되어 있습니다.

정규화(normalization)를 위한 참조 유전자 분석

5개의 검증된 참조 유전자 프라이머 세트를 dPCR에 사용할 수 있어 다양한 검체 유형에서 고품질 데이터 정규화 및 신뢰할 수 있는 데이터 생성이 가능합니다(아래 표 참조). 이러한 Control primer set는 다양한 인간 조직에 걸쳐 구성적으로 그리고 상대적으로 안정적으로 발현되는 내인성의 작은 non-coding RNA를 표적으로 합니다(그림  다양한 인간 조직에서 참조 유전자의 발현 수준 참조). 대조군 참조 유전자는 다양한 miRNA 발현 정도를 정확하고 안정적으로 정규화(normalization)할 수 있는 가능성을 제공합니다. 자세한 내용은 miRCURY PCR Controls 페이지를 참조하십시오.

사용 가능한 참조 유전자 분석 목록

* 디지털 PCR용으로 검증됨.

간단하고 신속한 플레이트 기반 워크플로우

분획, 서모사이클링 및 이미징이 모두 하나의 완전히 자동화된 기기에 통합되어 2시간 이내에 결과를 제공합니다. 나노플레이트 형식은 검체 준비를 위한 프런트 엔드 자동화가 가능하여 직접 실험 시간이 더욱 단축됩니다.
qPCR 실험과 마찬가지로 검체 준비에는 희석된 검체를 옮기고 마스터 믹스와 프라이머를 96-웰 또는 24-웰 나노플레이트에 첨가하는 작업이 포함됩니다. 이 시스템은 분획, 열순환(thermocycling) 및 이미징을 하나의 완전 자동화 기기로 통합하여 사용자가 3시간 이내에 검체에서부터 결과를 얻을 수 있습니다. 표적 서열의 마이크로리터당 복제 농도뿐만 아니라 내장 품질 관리 옵션도 제공하는 Suite 소프트웨어에서 원격 분석을 수행할 수 있습니다.

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 QIAcuity Digital PCR System과 함께 디지털 PCR 분석을 통한 mature miRNA 정량화를 가능하게 합니다.