Ni-NTA Magnetic Agarose Beads

미량의 His 태그 단백질에 대한 고처리량 정제 및 His 태그를 사용한 다목적 자기 포획 분석에 사용

Products

Features

signal-to-noise 및 재현성 향상을 위한 직접 프레젠테이션
비드 수에 따른 광범위한 결합력
미가공 세포 용해물에서도 효과적인 스크리닝 절차
생체 분자 상호 작용 연구에 적합
완전 자동화를 위한 선택 사항

Product Details

Ni-NTA Magnetic Agarose Beads는 Ni-NTA Agarose 친화성 정제 기질로 코팅된 자성 입자입니다. His 태그가 있는 재조합 단백질을 고정화하고 정제하는 데 사용됩니다. His 태그의 히스티딘 잔류물은 고정화 니켈 이온의 배위 영역의 빈 위치에 높은 특이성과 친화성으로 결합됩니다. 단백질이 결합되면 자석을 사용하여 비드를 침전시키고 세척한 후 기본 또는 변성 조건에서 소량의 완충액에 단백질을 용출할 수 있습니다.

Principle

Ni-NTA Magnetic Agarose Beads(그림 Ni-NTA Magnetic Agarose Beads 현미경 사진 참조)를 포함하여 QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System은 6개 이상의 히스티딘 잔류물의 친화성 태그(His 태그)를 포함하는 단백질에 대한 특허받은 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) 수지의 뛰어난 선택성을 기반으로 합니다. 이 기술을 사용하면 기본 또는 변성 조건의 모든 발현 시스템에서 거의 모든 His 태그 단백질을 한 번에 정제할 수 있습니다(그림 Ni-NTA 단백질 정제 시스템을 사용한 단백질 정제 참조). 니켈 이온에 대한 킬레이트화 부위가 4개인 NTA는 금속 이온과 상호 작용할 수 있는 부위가 3개뿐인 금속 킬레이트 정제 시스템보다 니켈을 더 단단히 결합합니다. 여분의 킬레이트화 부위는 니켈 이온 침출을 방지하여 다른 금속 킬레이트화 정제 시스템을 사용하여 얻은 것보다 결합력과 순도가 더 높은 단백질 제제를 생성합니다. QIAexpress 시스템은 baculovirus, 포유류 세포, 효모, 박테리아를 포함한 모든 발현 시스템에서 His 태그 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다.

See figures

Ni-NTA Magnetic Agarose Beads 현미경 사진

Micro-scale의 단백질 정제.

Procedure

His 태그 단백질의 정제는 세포 용해, 결합, 세척, 용출의 4단계로 구성됩니다(그림 미량의 단백질 정제 참조). QIAexpress 시스템을 사용한 재조합 단백질의 정제는 단백질 또는 His 태그의 3차원 구조에 의존하지 않습니다. 따라서 기본 또는 변성 조건에서 희석액과 미가공 용해물에 있는 단백질을 한 번에 정제할 수 있습니다. 강력한 변성제와 세제는 수용체와 막 단백질 그리고 봉입체를 형성하는 단백질을 효율적으로 용해화하고 정제하는 데 사용할 수 있습니다. 비특이적으로 결합하는 오염 물질을 효율적으로 제거할 수 있는 시약을 세척 완충액에 포함할 수 있습니다(표 참조). 정제된 단백질은 100~250mM 이미다졸을 경쟁 요소로 추가하거나 pH를 낮춰 온화한 조건에서 용출합니다.

His/Ni-NTA 상호 작용과 호환되는 시약
변성제	세제	환원제	기타	염	장기 보관용
6 M Gu·HCl	2% Triton X-100	20mM β-ME	50% 글리세롤	4M MgCl₂	최대 30% 에탄올
8M urea	2% Tween 20	10mM DTT	20% 에탄올	5mM CaCl₂	또는 100mM NaOH
	1% CHAPS	20mM TCEP	20mM 이미다졸	2M NaCl

See figures

Micro-scale의 단백질 정제.

Applications

Ni-NTA Magnetic Agarose Beads를 비롯한 QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System은 단백질을 신뢰할 수 있는 단일 단계로 정제하여 다음을 포함한 모든 응용 분야에 적합합니다.

구조 및 기능 조사
3차원 구조 측정을 위한 결정화
단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호 작용을 포함하는 분석
항체 생성을 위한 면역화

Supporting data and figures

Micro-scale의 단백질 정제.

Resources

Publications

A highly specific system for efficient enzymatic removal of tags from recombinant proteins.

Schäfer F; Schäfer A; Steinert K;

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Modulating RssB activity: IraP, a novel regulator of sigma(S) stability in Escherichia coli.

Bougdour A; Wickner S; Gottesman S;

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Bending fatigue study of nickel-titanium Gates Glidden drills.

Luebke NH; Brantley WA; Alapati SB; Mitchell JC; Lausten LL; Daehn GS;

J Endod; 2005; 31 (7):523-5 2005 Jul PMID:15980713

Ionic interactions between PRNA and P protein in Bacillus subtilis RNase P characterized using a magnetocapture-based assay.

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Human phosphatidylinositol 4-kinase isoform PI4K92. Expression of the recombinant enzyme and determination of multiple phosphorylation sites.

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Eur J Biochem; 2001; 268 (7):2099-106 2001 Apr PMID:11277933

FAQ

When working with small amounts of 6xHis-tagged protein in dilute solution, such as proteins expressed in mammalian cells or secreted into cell-culture medium, we recommend using Ni-NTA Magnetic Agarose Beads.

The total binding capacity of Ni-NTA Magnetic Agarose Beads is 3 µg of protein per 10 ul of magnetic bead suspension. Adjusting the amount of beads to the amount of 6xHis-tagged protein to be captured is crucial for optimal performance. The small elution volumes used provide high 6xHis-tagged protein concentrations, and allow detection of the purified proteins using Coomassie-stained SDS polyacrylamide gels.

Please see protocol 15 in the QIAexpressionist Handbook for detailed descriptions of a procedure to purify 6xHis-tagged proteins from transfected mammalian cells.

FAQ ID -134

Imidazole does not interfere with most downstream applications and therefore does not need to be removed. If it is necessary to remove the imidazole (e.g., for some sensitive enzyme assays), it can be easily achieved by dialysis, precipitation (e.g., ammonium sulfate), or ultrafiltration.

FAQ ID -91

FEATURES	BENEFITS
The interaction of the 6xHis tag with Ni-NTA matrices is conformation independent	One-step purification can be carried out under native or denaturing conditions
Mild elution conditions can be used	Binding, washing, and elution are highly reproducible, and have no effect on protein structure. Pure protein products are ready for direct use in downstream applications
The 6xHis tag is much smaller than other commonly used tags	6xHis tags can be used in any expression system. The Tag does not interfere with the structure and function of the recombinant protein
The 6xHis tag is uncharged at physiological pH	The 6xHis tag does not interfere with secretion
The 6xHis tag is poorly immunogenic	The recombinant protein can be used without prior removal of the tag as an antigen to generate antibodies against the protein of interest
Using Factor Xa Protease, 6xHis tag can be easily and efficiently removed	The detagged protein can be used for crystallographical or NMR studies where removal of the 6xHis tag may be preferred
Some QIAexpress vectors feature a 6xHis-dihydrofolate reductase tag (6xHis-DHFR tag)	Small peptides fused to the 6xHis DHFR tag are stabilized while being expressed. The 6xHis-DHFR tag is not highly immunogenic in mouse and rat, so that peptides fused to the tag can be used directly for immunizations or epitope mapping

FAQ ID -193

Yes, Ni-NTA Agarose and Superflow will bind a 6xHis-tag whether it is located internally or at the C- or N-teminal end of the protein. Note that the His-tag must be exposed for binding at the surface of the protein to allow for efficient purification under native conditions.

FAQ ID -496

Yes, please follow the Supplementary Protocol 'Purification of 6xHis-tagged proteins using the BioSprint 96 Workstation' (BS17).

FAQ ID -1167

Use 10-20 mM imidazole in the lysis and wash buffers (both for native and denaturing conditions). Optimal imidazole concentrations have to be determined empirically.
Increase the NaCl concentration (up to 2 M) in the purification buffers to reduce the binding of contaminants as a result of nonspecific ionic interactions.
Add ß-mercaptoethanol (up to 20 mM) to the lysis buffer to prevent copurification of host proteins that may have formed disulfide bonds with the protein of interest during cell lysis.
Add detergents such as Triton X-100 and Tween 20 (up to 2%), or additives such as glycerol (up to 50%) or ethanol (up to 20%) to reduce nonspecific binding to the matrix due to nonspecific hydrophobic interactions.
Reduce the amount of Ni-NTA matrix. Low-affinity binding of background proteins will be reduced by matching the total binding capacity of Ni-NTA matrix with the expected amount of 6xHis-tagged protein.

FAQ ID -102