Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit

6xHis 태그 단백질의 중간 용량 자동 정제에 사용

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Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit (4)

Cat. No. / ID: 969261

6xHis-tagged 단백질 제제에 사용 (4 x 96) : QIAfilter 96 플레이트 4개, TurboFilter 96 플레이트 4개, 100ml Ni-NTA Superflow 1개

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₩2,572,000.00

Quantity

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit은/는 분자생물학 분야에 사용하기 위한 것입니다. 이 제품은 질병의 진단, 예방, 또는 치료용이 아닙니다.

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Features

웰당 최대 2mg의 단백질 완전 자동 정제
교차 오염이 없는 고순도 단백질
기본 또는 변성 조건에서의 정제

Product Details

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit는 샘플 96개에서 최대 300µg의 재조합 단백질을 동시에 자동 정제합니다(표준 프로토콜, 샘플당 배양액 용량 5ml ). 투명 박테리아 세포 용해물은 BioRobot 워크스테이션에서 Ni-NTA Superflow를 미리 넣은 필터 플레이트로 흐릅니다. 이 고유한 96-well 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 모듈은 His 태그 단백질을 강력하고 선택적으로 결합합니다. 기본 또는 변성 조건에서의 정제에 바로 실행할 수 있는 프로토콜이 제공됩니다.

Performance

QIAGEN은 자동화된 절차를 통한 단백질 양 증가를 원하는 고객의 요구에 부응하여 Ni-NTA Superflow 96 BioRobot 프로토콜을 조정했습니다. 이를 통해 더 많은 배양액 용량을 처리하고 웰당 최대 2mg의 His 태그 단백질을 정제할 수 있게 되었습니다. 절차에 사용되는 Ni-NTA Superflow 수지의 양을 웰당 200µl로 늘리고 최적화된 용해 완충액 제제를 사용하면 배양액을 25ml(기본 조건에서 정제) 또는 15ml(변성 조건에서 정제)까지 처리할 수 있습니다(고수율 프로토콜). 세포 배양액은 처리를 위해 24-well 블록으로 이동합니다. 그에 상응하는 바이오매스 증가로 웰당 순수 His 태그 단백질의 수율이 높아질 수 있습니다(표 및 그림 웰당 His 태그 단백질의 양(단위: mg) 참조). 이에 따라 동일한 배치의 단백질에 다양한 분석을 수행하여 필요한 총 단백질 제제 수를 줄일 수 있습니다(그림 자동 발현 클론 스크리닝 참조). 단일 단계 정제로 광범위한 수율에 걸쳐 고순도 단백질을 제공하고 대형 단백질 복합체를 정제할 수 있습니다.

적합한 Ni-NTA Superflow 96 BioRobot 프로토콜을 사용한 His 태그 단백질의 수율
His 태그 단백질	웰당 총수율 (µg)*	단백질 농도 (mg/ml)†
녹색 형광 단백질	4000	6.0
T7 RNA 중합효소	1000	1.4
GroES	300	0.4
Chloramphenicol acetyltransferase	2400	4.4
GroEL	740	1.0
종양 괴사 인자 α	1600	2.5
GroES/GroEL	1200	1.5
Cpn-10	170	0.3

* 550µl 용출 분획 2개에서 얻은 수율(독립된 정제 6회에 대한 평균). 처음 550µl에서 단백질의 80%가 용출됩니다.
† 첫 번째 550µl 용출 분획의 단백질 농도

See figures

웰당 순수 His 태그 단백질의 양(단위: mg).

자동화된 발현 클론 스크리닝.

Principle

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit를 포함하여 QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System은 6개 이상의 히스티딘 잔류물의 친화성 태그(His 태그)를 포함하는 단백질에 대한 특허를 받은 Ni-NTA(Nickel-Nitrilotriacetic Acid) 수지의 뛰어난 선택성을 기반으로 합니다. 이 기술을 사용하면 기본 또는 변성 조건의 모든 발현 시스템에서 거의 모든 His 태그 단백질을 한 번에 정제할 수 있습니다. 니켈 이온에 대한 킬레이트화 부위가 4개인 NTA는 금속 이온과 상호 작용할 수 있는 부위가 3개뿐인 금속 킬레이트 정제 시스템보다 니켈을 더 단단히 결합합니다. 여분의 킬레이트화 부위는 니켈 이온 침출을 방지하여 다른 금속 킬레이트화 정제 시스템을 사용하여 얻은 것보다 결합력과 순도가 더 높은 단백질 제제를 생성합니다. QIAexpress 시스템은 baculovirus, 포유류 세포, 효모, 박테리아를 포함한 모든 발현 시스템에서 His 태그 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다. (그림 Ni-NTA 단백질 정제 시스템을 사용한 단백질 정제를 참조하십시오.)

See figures

Procedure

His 태그 단백질의 정제는 세포 용해, 결합, 세척, 용출의 4단계로 구성되며, Ni-NTA Superflow BioRobot Kit의 기반입니다(그림 참조). QIAexpress 시스템을 사용한 재조합 단백질의 정제는 단백질 또는 6xHis 태그의 3차원 구조에 의존하지 않습니다. 따라서 기본 또는 변성 조건에서 희석액과 미가공 용해물에 있는 단백질을 한 번에 정제할 수 있습니다. 강력한 변성제와 세제는 수용체와 막 단백질 그리고 봉입체를 형성하는 단백질을 효율적으로 용해화하고 정제하는 데 사용할 수 있습니다. 비특이적으로 결합하는 오염 물질을 효율적으로 제거할 수 있는 시약을 세척 완충액에 포함할 수 있습니다(표 참조). 정제된 단백질은 100~250mM 이미다졸을 경쟁 요소로 추가하거나 pH를 낮춰 온화한 조건에서 용출합니다.

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit는 BioRobot 3000, 8000 또는 9600 워크스테이션용입니다. .

His/Ni-NTA 상호 작용과 호환되는 시약
변성제	세제	환원제	기타	염	장기 보관용
6 M Gu·HCl	2% Triton X-100	20mM β-ME	50% 글리세롤	4M MgCl₂	최대 30% 에탄올
8M urea	2% Tween 20	10mM DTT	20% 에탄올	5mM CaCl₂	또는 100mM NaOH
	1% CHAPS	20mM TCEP	20mM 이미다졸	2M NaCl

See figures

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit.

Applications

QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System은 단백질을 신뢰할 수 있는 단일 단계로 정제하여 다음을 포함한 많은 응용 분야에 적합합니다.

구조 및 기능 조사
3차원 구조 측정을 위한 결정화
단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호 작용을 포함하는 분석
항체 생성을 위한 면역화

Supporting data and figures

자동화된 발현 클론 스크리닝.

발현 클론 스크리닝 및 단백질 특성화를 위한 중간 규모 정제. 12, 15, 28 kDa 단백질 발현을 위한 벡터 구축물과 48/50 kDa 헤테로다이머로 된 혼합물을 E. coli로 변환하고 선택 배지에 플레이팅한 후 배양물 5ml를 접종할 콜로니 96개를 무작위로 선택했습니다. IPTG를 사용하여 야간에 6xHis 태그 단백질 발현을 유도했습니다. 세포를 펠릿화하고 용해한 후 6xHis 태그 단백질을 정제했습니다. SDSPAGE 분석을 위해 각 용출 분획 5μl를 넣고 쿠마시 염색으로 단백질을 가시화했습니다.

Resources

Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.

For Automated medium and large-scale purification of 6xHis-tagged proteins

The two protocols given below are for the use of the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot® Kit in manual procedures. The kit has been specially designed and optimized for automated 6xHis-tagged protein purification on QIAGEN® BioRobot Systems. For more details of the advantages of BioRobot Systems see the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit Handbook supplied with the kit or contact one of the QIAGEN Technical Service Departments or local distributors listed on the last page of the handbook.

The following protocols have been designed for the use of Ni-NTA Superflow Columns on the QIAvac 6S vacuum manifold or in gravity-flow applications on the QIArack. Up to 15 mg 6xHistagged protein can be purified per column from cleared lysate derived from up to 1 liter of (E. coli) bacterial culture.

FAQ

We recommend to use the EasyXpress Linear Template Kit Plus to generate PCR products optimized for use in protein expression with the EasyXpress Insect Kit II.

This kit uses specially designed primers to amplify coding DNA sequence and supplement it with regulatory elements required for optimal transcription and translation in cell-free expression systems. In addition, specially designed 5' untranslated regions (UTRs) on the sense adapter primer sequences reduce the formation of secondary structure in the translation initiation region, one of the commonest causes of low expression rates. A His-or Strep-tag II can be added to either terminus, greatly simplifying protein purification and detection after expression.

FAQ ID -1221

FEATURES	BENEFITS
The interaction of the 6xHis tag with Ni-NTA matrices is conformation independent	One-step purification can be carried out under native or denaturing conditions
Mild elution conditions can be used	Binding, washing, and elution are highly reproducible, and have no effect on protein structure. Pure protein products are ready for direct use in downstream applications
The 6xHis tag is much smaller than other commonly used tags	6xHis tags can be used in any expression system. The Tag does not interfere with the structure and function of the recombinant protein
The 6xHis tag is uncharged at physiological pH	The 6xHis tag does not interfere with secretion
The 6xHis tag is poorly immunogenic	The recombinant protein can be used without prior removal of the tag as an antigen to generate antibodies against the protein of interest
Using Factor Xa Protease, 6xHis tag can be easily and efficiently removed	The detagged protein can be used for crystallographical or NMR studies where removal of the 6xHis tag may be preferred
Some QIAexpress vectors feature a 6xHis-dihydrofolate reductase tag (6xHis-DHFR tag)	Small peptides fused to the 6xHis DHFR tag are stabilized while being expressed. The 6xHis-DHFR tag is not highly immunogenic in mouse and rat, so that peptides fused to the tag can be used directly for immunizations or epitope mapping

FAQ ID -193

Yes, Ni-NTA Agarose and Superflow will bind a 6xHis-tag whether it is located internally or at the C- or N-teminal end of the protein. Note that the His-tag must be exposed for binding at the surface of the protein to allow for efficient purification under native conditions.

FAQ ID -496

Yes, please follow either of the QIAGEN Supplementary Protocols:

FAQ ID -967