디지털 PCR 워크플로우 및 제품

디지털 PCR 실험 설정 방법에 관한 상세한 가이드라인과 단계별 튜토리얼은 QIAcuity 애플리케이션 가이드에서 확인할 수 있습니다.   디지털 PCR 실험 설정 및 결과 보고 시의 추가적인 고려사항은 디지털 MIQE 가이드라인 및 업데이트(Huggett JF et al, 2013 and 2020)를 참조하시기 바랍니다.  

QIAcuity는 포일로 덮인 플레이트 아랫부분에서 방출된 형광도를 판독합니다. 최상의 결과를 얻으려면 포일을 깨끗하게 유지하고 긁힘과 같은 손상이 생기지 않도록 하세요. 또한, 플레이트 측면의 바코드를 깨끗하고 손상되지 않은 상태로 유지하세요. 플레이트를 취급할 때 장갑을 착용하고 무리한 힘을 가하지 마세요. 플레이트를 안전하게 취급하려면 플레이트를 나노플레이트 트레이에 넣으세요.

dPCR 시스템 소프트웨어는 일차 및 이차 분석을 제공할 가능성이 높습니다. 일차 분석에는 농도 다이어그램, 관심 있는 웰 분획 보기 또는 표적 채널을 참조 채널과 비교하는 열 지도가 포함될 수 있습니다. 히스토그램과 산점도를 사용하여 임곗값 설정을 변경할 수 있습니다. 이차 분석에서는 사용 목적(돌연변이 검출, 유전자 발현 분석 등)에 따라 PCR 데이터를 분석할 수 있습니다.

디지털 PCR용 프라이머 설계는 qPCR용 프라이머 설계와 유사합니다. 표적 매칭, 염기 구성, 앰플리콘 길이, 융해온도, 이차 구조, 자체 및 상호 상보성(self-annealing), 교차 반응성에 주의를 기울여야 합니다. 한 가지 차이점은 배경 노이즈에서 특정 신호를 더 잘 분리하기 위해 dPCR용 프라이머를 qPCR보다 더 높은 농도로 사용하는 경우가 많다는 것입니다.

대부분의 QIAcuity dPCR 공정에서 템플릿 DNA는 QIAcuity Nanoplate 반응 챔버 전체에 균일하게 분포되어 있습니다. PCR 제품 또는 고도로 단편화된 DNA(FFPE DNA, circulating cell-free DNA), 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA), gBlocks 등을 템플릿으로 사용하는 QIAcuity 반응에서는 PCR 신호의 균일한 분포가 관찰됩니다. 단, >20kb인 DNA 분자 또는 플라스미드는 고르지 않게 분획되어 템플릿 농도가 과도하게 정량화됩니다. QIAcuity 반응 혼합물에 제한 효소를 직접 추가하면 큰 템플릿을 더 작은 크기로 단편화할 수 있으므로 템플릿 분포가 균일하게 되고 정확한 정량화가 가능합니다. 이는 유전자의 여러 사본이 나란히 연결될 수 있는 사본 수 변이(Copy Number Variation, CNV) 분석에 특히 중요합니다. 반응 혼합물에 제한 효소를 추가할 때 사용자는 효소가 앰플리콘 시퀀스 내에서 절단하지 않도록 해야 합니다. 마스터 혼합물에 제한 효소를 포함하고 템플릿을 추가한 후 실온에서 10분 동안 배양하기를 권장합니다.

QIAcuity dPCR 기기는 FAM, EvaGreen, VIC, HEX, TAMRA, ROX 및 Cy5 등과 같은 염료를 검출할 수 있습니다. 

반응 혼합물에 사용되는 모든 DNA 샘플은 UV 분광광도법으로 쉽게 평가할 수 있는 유사한 품질과 양을 보여야 합니다. 평균 길이가 20kb 이상인 DNA 샘플(예: 실리카 멤브레인이 있는 스핀 컬럼을 통해 정제된 유전체 DNA)은 분획 전에 제한 효소 처리를 통해 단편화해야 합니다. 큰 DNA의 효소를 단편화하면 QIAcuity Nanoplate 전체에 템플릿이 고르게 분포되어 정확하고 정밀한 정량화를 할 수 있습니다.