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数字 PCR

dPCR 入门

dPCR 的发展

当今复杂的研究问题需要的信息深度超出了传统PCR技术的能力。第三代数字PCR缩小了这一差距，成为解决这些日常研究问题的更简单、更实用的技术。

数字 PCR 的概念出现于 1992 年，当时， Sykes 将其称为“有限稀释 PCR”。该通用方法采用了终点分析及泊松分布统计公式来量化样本中核酸分子的绝对数量。随后，Vogelstein 和 Kinzler 于 1999 年做出了重大贡献，他们开发出了一种方法，即，将样本稀释并分配至称为分区的单个反应单元中，并在扩增后检测及分析带有荧光信号的单个产物。当时他们创造了“数字 PCR”这个沿用至今的术语。

多年来，人们对这些方法进行了创新和商业化，以扩大其应用范围。数字 PCR 可在微流控芯片及微流磁盘、微阵列及基于油水乳液的微液滴或液滴晶体上进行；最近以来，还可在类似 qPCR 的孔板中进行。

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什么是数字 PCR？
了解数字 PCR 的基础知识、工作原理、优势和局限性概述以及应用范围。
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数字 PCR 的威力
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了解它可为您做些什么

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数字 PCR 是一项高度精确的技术，可实现高灵敏性和高度可重复性的核酸检测及定量。其测定方法包括将样本微分化到多个反应分区中，单个反应分区中只包含零个、一个或多个靶标分子。每个微分区在终点PCR扩增后分析荧光信号存在(阳性反应)或不存在(阴性反应)，并计算样品中存在的靶标分子的绝对数量。采用该技术进行样本靶标基因定量时，无需依赖标准曲线。消除对标准曲线的依赖可以减少误差并提高精度。

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4 步实现绝对定量

样本稀释和 PCR 反应混合物配制
样本稀释和 PCR 反应混合物配制
蓝色——靶标红色——背景（gDNA，cDNA；引物/探针；预混液）
将 PCR 反应体系微分化成成千上万个独立的反应单元
将 PCR 反应体系微分化成成千上万个独立的反应单元
各反应分区的终点 PCR 扩增
各反应分区的终点 PCR 扩增
绿色——阳性反应，蓝色——阴性反应
读取结果及绝对定量
读取结果及绝对定量
分而治之

虽说样本制备步骤与 qPCR 相同，但是数字 PCR 中有一个独特的“微分化”步骤，在这个步骤中，样本在扩增前被微分化成成千上万个独立的反应单元。与 qPCR 中的整体分析不同，数字 PCR 通过将核酸分子随机分配到各反应分区中，可有效地减少竞争靶点的影响，提高了对罕见物的检测精度和灵敏度。

研究者可使用数字 PCR 来：

  • 定量低丰度靶标或复杂背景中的靶标
  • 检测和区分等位基因突变（SNP）
  • 监测 qPCR 无法检测到的靶标基因微小倍数变化
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微分化的三大优势

可提高有效浓度
  • 可提升检测下限（LOD）
  • 可扩增并检测单个靶标分子
可赋予富集效果
  • 可提高靶标与背景的比率
可提供优越的精确性和线性度
  • 可测量单个分子的数量而非整体浓度
  • 反应分区越多，精确性越高
  • 反应分区越多，动态范围越大
dPCR与qPCR的选择
将这两种方法进行比较和对比，以了解哪一种方法最适合您的需求，并了解如何将您现有的 qPCR 转移到 dPCR。
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泊松分布法则为微分化带来意义

与实时 qPCR 不同，数字 PCR 不依赖于每个扩增循环后荧光信号的检测以确定靶标分子的相对定量；它依赖于泊松分布统计公式以确定终点扩增后靶标分子的绝对定量。

鉴于靶标分子被随机分配至所有有效的反应分区中，泊松分布可估计每个反应分区的平均分子数目（零个、一个或多个），并计算出每个反应分区中的靶标分子的拷贝数。对阳性和阴性反应分区数目进行泊松分布统计分析可获得靶标序列的准确绝对数量。

将统计学用于绝对定量

就数字 PCR 实验而言，绝对定量依赖于靶标分子在分区上的随机分布，数据应该符合泊松分布。“泊松分布”在 1837 以法国数学家 Siméon Denis Poisson 的名字命名，用于指示给定数目的事件在某个固定时期内的发生几率，前提条件是这些事件以已知的恒定速率发生且独立于前次事件发生。


Given: V alid pa r titions: 8000 Positive partitions: 4000 λ = −ln number of valid partitions ‒ number of positive partitions number of valid partitions λ = −ln 8000 ‒ 4000 8000 = 0.693 Calculated target copies per partition λ = −ln number of valid partitions ‒ number of positive partitions number of valid partitions Given: P a r tition volume is V = 0. 2 3 nl λ volume = λ V [µ l ] 1 000 = 3013 copies/µl Calculated target copies per µl λ volume = 0.693 0.23 x Simple mathematical computation of the Poisson law for a digital PCR experiment looks like this: λ is t h e expectation value for t h ese events and will tell what t h e most li k ely ave r age value of copies/pa r titions is Computing the estimated concentration of target genes in copies/µl
dPCR 初学指南
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大海捞针——数字 PCR 的威力
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数字 PCR 常见问题简答

绝对与相对定量之间的区别是什么？
数字 PCR 绝对定量计数的是样本中存在的分子的数量。不需要采用已知（浓度）的标准品。在qPCR中使用标准曲线进行绝对定量时，未知的量将使用已知的量进行定量。相对定量是使用参考样本来比较和确定相关反应中模板DNA的原始拷贝数。
PCR 技术有哪些应用？
PCR 技术的应用包括测定靶标核酸是否存在、基因分型、基因表达定量、检测方法验证、微生物靶标检测以及 NGS 文库定量等。
dPCR 的准确性如何？
数字 PCR 是一种准确的核酸定量方法。研究表明，dPCR 能够显著提高解析低拷贝或计数单个分子的精确度，尤其是在存在抑制剂或野生型群体的情况下。与传统 qPCR 相比，数字 PCR 具有更低的检出限和更高的实验室内重复性。
dPCR 的工作原理是什么？
你会感到欣慰的是，最初的dPCR反应是使用类似于qPCR的熟悉检测组份。但是，通过将每个样本离散/分散成大量独立的或并行的小反应分区，某些反应分区中将包含一个或多个靶标分子，而其他反应分区中将不包含靶标分子。样本微分化方式可包括将样本分入含有毛细管或通道的微孔板、成矩阵排列的微型腔室中或水油乳液滴中来实现。每个反应分区中均进行 PCR 扩增直至终点。分别对包含和不包含扩增产物的反应分区进行计数。包含扩增产物且显示荧光信号的反应分区被指定为阳性且记为“1”；不包含扩增产物只存在背景信号的反应分区被指定为阴性且记为“0”。随后应用泊松分布统计公式来确定靶标分子在初始样本中的绝对浓度，而无需依赖参照或标准品。
哪些应用可受益于 dPCR？
起始模板浓度低或目标量分辨率较低的应用，诸如罕见事件检测、拷贝数变异分析及低丰度转录物的基因表达分析等应用，都可显著受益于 dPCR 的微分化效应。诸如液体活检、单细胞分析、NGS 文库定量、低病毒及细菌负荷定量、基因编辑事件分析和 GMO 检测等应用也可以利用数字 PCR 与 qPCR 相比所具有的出色的精确度和灵敏度。对于大多数研究者而言，dPCR 是 qPCR 的补充。
dPCR 中可使用什么类型的模板？
可用的起始材料可以是从血液、组织、细胞、肿瘤、细胞培养、拭子和灌洗液中分离出的基因组 DNA、FFPE DNA（福尔马林固定石蜡包埋 DNA）、cfDNA（循环游离 DNA）、ctDNA（循环肿瘤 DNA）、亚硫酸氢盐处理的 DNA、环境 DNA、cDNA、细菌 DNA、病毒 DNA、质粒 DNA、文库 DNA 及合成 DNA(如gBlocks和长链寡核苷酸)，也可以是总 RNA、microRNA、lncRNA、病毒 RNA、细菌 RNA 和体外转录的 RNA。
数字 PCR 与微滴式数字 PCR 是否相同？
不，因为数字 PCR 是所有数字 PCR 方法的总称，而不仅仅是微滴式数字 PCR (ddPCR)。例如，ddPCR 使用微滴作为 PCR 样本的反应分区，而其他数字 PCR 方法则基于微流控孔板、微流控芯片或其他原理。
数字 PCR 与普通 PCR 有何不同？
这取决于普通 PCR 的定义。终点法 PCR 依靠凝胶电泳对核酸进行定性或半定量分析。定量 PCR (qPCR) 能够基于标准曲线实时测定核酸浓度。数字 PCR 通过将终点法 PCR 与微分化技术和统计学方法相结合，提供核酸的绝对定量。
什么是数字 PCR 检测？
数字 PCR 检测是一种对核酸进行绝对定量的方法。PCR 反应被微分化为成千上万个反应分区，靶标核酸在反应分区内进行独立扩增。使用荧光探针或染料检测每个反应分区中是否存在扩增产物。
数字 PCR 与 ddPCR 之间的区别是什么？
数字 PCR 与微滴式数字 PCR (ddPCR) 的区别在于微分化方式。在纳米微孔板 dPCR 中，样本在微流控 dPCR 孔板上被微分化为成千上万个反应分区。而在微滴式数字 PCR (ddPCR) 中，样本被分为数千至数百万个微滴，然后在微滴读取仪上逐个进行分析。
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