

数字 PCR 实验流程 — 概述
样本制备 — dPCR assay
样本纯度
由于 PCR 依赖于多轮酶促反应,与单步酶促反应相比,其对蛋白质、酚/氯仿、盐和 EDTA 等杂质更为敏感。核酸模板的纯度对 dPCR 而言非常重要,因为污染物会干扰荧光检测。
- 醇类(乙醇、异丙醇)和盐会影响引物和探针的退火性能、降低扩增效率(如降低阳性荧光信号)以及阻碍阳性和阴性反应分区的区分
- 腐殖酸会淬灭 dsDNA 结合染料(如 EvaGreen)的荧光
- 核酸酶会降解 RNA 和 DNA
- 尿素和苯酚会使 Taq 聚合酶变性
- 酸性多糖会模拟核酸并与 Taq 聚合酶形成末端复合物
尽管与 qPCR 相比,dPCR 对抑制剂耐受度更强,但使用高纯度模板的效果更佳。根据模板的不同,有多种试剂盒(如基因组 DNA、质粒 DNA、总 RNA 等)可实现高核酸纯度和 PCR 效率。
样本完整性:长度和序列
扩增子长度和序列与模板纯度一样影响 dPCR 实验的成功。降解严重的 RNA 和 DNA 模板,往往 OD 值定量的 DNA 数量与 dPCR 扩增和检测到的拷贝数之间存在差异。实现期望的灵敏度(如突变检测),可能需要高于预期的 DNA 数量。建议保持扩增子尽可能短,特别是当使用降解严重的样本时(FFPE DNA、cfDNA)。同样,残留的交联可以阻止链分离和扩增,无碱基位点可以诱导非特异性扩增。可使用从 FFPE 样品中回收高质量 gDNA 的专用试剂盒和方案。
以下情况,建议在数字 PCR 检测之前使用限制性酶切:
- 高黏度溶液 – 高黏度可能会降低检测的准确性,尤其是在较小的体积中使用较大量 DNA 时。使用限制性酶切降低黏度,可在 dPCR 实验流程中使用更高的 DNA 浓度 (1 µg)。
- 连锁或串联基因拷贝 – 如果一个阳性反应分区包含多个拷贝,则连锁的拷贝将被计为一个拷贝。可以通过使用限制性酶切来物理分离基因拷贝,以独立分离至反应分区来克服这个问题。
- 超螺旋质粒 – 建议使用限制性酶切使质粒 DNA 线性化,并提高引物/探针与 DNA 结合的可及性和效率。这会提高质粒定量的准确度。
- 长片段 DNA 分子 (>30 kb) – 长片段 DNA 分子可能会被不均匀地微分化,进而导致模板浓度过度定量。限制性酶切有助于将长片段模板切割为短片段,从而实现均匀分布和更准确定量。
样本投入量
样本投入量取决于所使用的 dPCR 技术。在 QIAcuity 纳米微孔板数字 PCR 中,26k 纳米微孔板每个反应最多可投入 217,000 个拷贝,8.5k 纳米微孔板每个反应最多可投入 170,000 个拷贝。如何计算拷贝数
如果生物体的单倍基因组大小是已知的,可通过使用下列方程式计算出基因组 DNA (gDNA) 输入质量与获得的拷贝数(对于单拷贝基因)之间的相关性:
基因组大小 (bp) x 单个碱基对的平均重量 (1.096 x 10–21 g/bp)
例如,对于基因组大小约为 3.3 x 109 bp 的人类基因组,计算如下:
3.3 x 109 bp x 1.096 x 10−21 g/bp = 3.3 x 10−12 g = 3.3 pg
下表显示了几种模式生物 10 ng gDNA 的拷贝数
样本重复
建议对样本进行一式两份或一式三份分析,以防止因移液误差导致的定量偏差。复孔数据相加会增加检测事件数量。这有助于提高数字 PCR 检测的精确度。
对照
- 阴性对照 – 需要监测假阳性反应,可能是污染或引物和探针的问题引起的。阴性对照也被用于确定检测限 (LOD)。
- 阳性对照 – 用于测试在设定的反应条件下模板是否会发生扩增
- 无模板对照 (NTC) – 质控所有试剂中的污染
检测化学试剂
如何设计引物和探针
引物和探针的存储
除了谨慎的 assay 设计以及恰当浓度外,引物和探针的正确存储对 dPCR 的成功也至关重要。
冻干的引物和探针应溶解在少量低盐缓冲液中,如 100 µM TE 缓冲液 (10 mM Tris·Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0),以获得浓缩储存液。作为例外,Cy5 和 Cy5.5 荧光基团标记的探针应储存在 pH 7.0 的 TE 缓冲液中,因为它们在较高的 pH 下会发生降解。
引物存储时,小等份溶于无核酸酶 TE 缓冲液中可在 -20°C 保存至少 1 年。荧光标记的探针在相同的条件下可稳定 6 至 9 个月。应避免反复冻融,降低降解风险。
对于 dPCR 多重检测引物-探针组合,可使用 20x 引物-探针混合物,在建议浓度下针对特定靶标有 2 个引物和 1 个探针。
溶解引物和探针,应将含有冻干引物或探针的试管轻轻离心,以收集管底部的所有物质。加入所需体积的无菌无核酸酶 TE 缓冲液,混匀后静置 20 分钟,使引物或探针完全溶解。引物或探针溶液应再次混合,并用分光光度法测定浓度。dPCR 故障排查提示避免将引物和探针溶解在水中。其中一些引物和探针在水中的溶解度和稳定性比在 TE 缓冲液中低。
dPCR 运行
样本加载技巧
三个步骤的第一步是制备和加载样本。在 PCR 混合物制备和加载纳米微孔板的过程中,可以参考以下建议:
- 清洁工作场所和实验室器具,以降低外来 DNA 污染风险
- 为确保最高的 PCR 效率,在进行主要数字 PCR 检测之前,可对不同稀释度样本进行测试
- 在反应混合物制备之前,请解冻所有组分并充分混匀以获得均匀的溶液,短暂离心以避免溢出。
- 将预混液与样本、引物、无 RNAase 水以及限制性酶(如果使用)混合
- 使用无菌移液器吸头
- 使用移液器将反应混合物移入纳米微孔板内。确保在样本转移和微孔板下游运送过程中,没有气泡被引入到板孔中
- 为防止蒸发和污染,请使用封板滚轮和封膜小心地密封纳米微孔板
- 将纳米微孔板放入 dPCR 仪器时,只需握住微孔板的侧边缘,避免摇晃或转动,以确保 dPCR 反应混合物停留在输入孔的底部
- 设置软件并启动 dPCR 运行
扩增技巧
三个步骤的第二步是运行 dPCR 程序。在该步中,每个孔中的反应混合物被微分化为成千上万个反应单元。在热循环模块上进行 PCR 反应。如果反应分区内存在靶标模板,则在成像期间可检测到阳性荧光信号。图像由专用软件进行处理。 通过dPCR 仪器本身或使用连接的软件,可监测当前的微孔板状态。
获得最佳扩增和 PCR 效率的技巧包括:
- 退火温度 – 影响 dPCR assay 的特异性,通常设置为 55°C 和 65°C 之间,当阳性和阴性反应分区达到最大分离时为最佳的退火温度;提高退火温度有利于改善阳性信号与背景噪音间的分离
- 扩增循环 – 建议运行 40 个扩增循环,以实现阳性信号与背景噪声之间的充分分离。在一些情况下,可能必须提高热循环数量,以实现优异的性能
数字 PCR 数据分析
三个步骤的最后一步,使用基于泊松分布统计公式的绝对定量进行数字 PCR 数据分析。
QIAcuity Software Suite 可以根据具体的应用目的进行数字 PCR 数据分析:绝对定量、突变检测、基因组编辑、拷贝数变异或基因表达。在绝对定量分析(一级分析)中,该软件生成浓度图以及所选板孔阳性和阴性反应分区视图。热图视图可并列显示靶标通道和参比通道。直方图和散点图可用于更改阈值设置和重新计算结果。在 QIAcuity Software Suite 中,您可以创建关于微孔板分析结果的报告。绝对定量是所有后续计算和二级分析(如突变检测分析、基因表达分析、拷贝数变异分析等)的先决条件。
数字 PCR 数据分析技巧:
- 将阳性和阴性反应分区的分类阈值设置为略高于阴性反应分区簇
- 使用仅具有阴性反应分区的 NTC 样本来协助设置阈值,同时也可对所有板孔进行检查
- 您可以将单个孔的荧光振幅设置为略高于或低于 NTC,以避免某些反应分区的错误分类
- 尽管不存在共识值,但当阳性反应分区数超过 2 个时,反应通常被认为是阳性
- 为解决孔与孔之间和批次与批次之间的差异,可使用体积精度因子 (VPF) 来定义每个孔的确切体积,并通过软件应用该因子进行浓度计算
数字 PCR 数据示例
数字 MIQE ( dMIQE) 指南
dMIQE 指南清单中的条目被认为是发表 dPCR 结果时必须报告的内容。需要报告的信息包括但不限于:
- 每个反应分区的平均 DNA 靶标拷贝数 (λ)
-
反应分区数(与平均 DNA 靶标拷贝数一起,这些值可以确定 dPCR 检测的精确度)
-
模板结构信息,因为样本的性质可能会影响数据的准确性和可靠性:
- 单个反应分区模板类型:基因组、质粒等。
- 来源:生物体、组织、细胞、食物、植物等。
- 处理:限制性酶切、超声处理、预扩增、稀释、无
- 单个反应分区体积,该体积因 dPCR 平台而异
- 反应总体积,可通过反应分区数量乘以反应分区体积来计算
- 所用的对照品类型
- 阳性和阴性实验数据的代表性扩增图或终点荧光值
- 实验方差示例,最好来自多个生物重复,以便更准确地捕捉实验的不确定性
- 其他
如何实现 qPCR 到 dPCR 的优化转移
dPCR assay 优化参数
然而,当使用一组新的 assay 时,建议进行初步试验测试来评估其性能。建议在适当的背景基质中使用特征良好且具有代表性的对照品。如果性能欠佳,则应优化 assay 以确保分析准确性。在这种情况下,报告优化过程的细节对重复性至关重要。
为了快速优化性能欠佳的 assay 方案,可在退火步骤运行温度梯度,QIAcuity 预混液也可在任何 qPCR 仪器上使用。
数字 PCR 故障排查
dPCR 实验可能受到与 qPCR 或常规 PCR 类似问题的影响。然而,在进行数字 PCR 检测时可能会出现一些特定的挑战。下表作为典型 dPCR 方案中常见问题的 dPCR 故障排查指南,概述了可能的原因和我们的专家建议。
dPCR 优化的更多支持
参考文献
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The dMIQE Group and Hugget JF.The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020.2020; Clin Chem 66(8):1012-1029.