Enzymes, NGS, Black male pipetting in front of computer screen in a laboratory environment
分子生物学用酶试剂

RNA 分析

有一套酶试剂可用于操纵 RNA 以进行基因表达的下游分析。逆转录酶从转录物中产生互补 DNA (cDNA)。可以对 cDNA 进行标记或扩增用于克隆或定量研究。RNA 连接酶可以连接碱基、标签和接头,RNA 聚合酶可以添加核糖核苷酸,核糖核酸酶可以去除核糖核苷酸。 

逆转录酶是能够聚合与原始 RNA 模板互补的 DNA 链 (cDNA) 的酶。RNA 易被 RNase 降解,使用逆转录酶生产 cDNA 能够克服使用 mRNA 时面临的问题。cDNA 成为 RNA 研究(例如基因表达分析)的各种下游应用中的稳定模板。可以使用常规 PCR、qPCR、一步式 RT-qPCR 或等温方法进行 cDNA 模板的扩增。扩增后,可以使用常规酶方案进行克隆,或利用 T4 DNA 聚合酶的 3’→5’ 核酸外切酶活性进行不依赖于连接反应的克隆。 

所有逆转录酶(RNA 依赖性 DNA 聚合酶)均可用于:

合成 cDNA
合成 cDNA
  • 第一链 cDNA 合成
  • 合成双链 cDNA 用于克隆

使用 oligo(dT) 引发的 mRNA RT 产生具有 3' 端环的第一链 cDNA。去除 mRNA 后留下具有 3' 环的单链 cDNA 分子,可被逆转录酶作为引物用于第二链 cDNA 合成。

扩增 cDNA
扩增 cDNA
  • 逆转录 (RT) 和 RT-PCR
  • 定量 real-time RT-PCR

在 RT 中,使用逆转录酶以及基因特异性引物、随机寡聚体或 oligo(dT) 将分离的 mRNA 转化为 cDNA。RT-PCR 与 RT 相似,使用 cDNA 进行 PCR 扩增。RT-qPCR 将 PCR 扩增与检测及定量结合在一项检测中。

分析 mRNA
分析 mRNA
  • 引物延伸
  • cDNA 标记 

在引物延伸中,通过分析中间 cDNA 产物来鉴定编码 mRNA 的 5' 端,从而确定基因的转录起始位点。直接 cDNA 标记方案使用在 RT 反应期间掺入的修饰 dNTP。

    RNase H (+/-)
专业应用
P7600L
EnzScript
即将推出  - 用于长 cDNA 和具有高百分比全长 cDNA 的文库;
需要模板切换的应用,即 RNA Seq
P7720L
StableScript
即将推出

-

用于长 cDNA;提高了持续合成能力、抑制剂抗性和热稳定性
(最佳温度 55°C)

205111
Omniscript Kit

 + 微阵列标记;特别设计用于使用任何数量的 RNA
进行逆转录;优化的缓冲液;无需 RNase H 步骤

RNA 聚合酶,或更具体地说是 DNA 导向的 RNA 聚合酶,是利用 DNA 模板合成 RNA 的酶。Poly(A) 聚合酶使用单链 RNA 作为引物,通过催化腺嘌呤残基掺入 RNA 的 3’ 末端,将 poly(A) 尾部添加到 RNA 中。 

T4 RNA 连接酶在 RNA 分析中特别有用,尤其是高通量 RNA 测序和微阵列分析等上游程序。T4 RNA 连接酶 1 和 2 能够通过连接相邻的 3'-OH 和 5'-PO4 多核苷酸来标记、环化或执行 RNA 分子间连接。使用 T4 RNA 连接酶 1 将接头连接至 RNA 3’ 端是通过 RT-PCR 和高通量测序进行 RNA 定量和发现的第一步。

    作用 应用
P7180L
T7 RNA Polymerase
即将推出  以 5’→ 3’ 方向从 DNA 模板合成 RNA;
对 T7 启动子具有特异性
  • 体外 mRNA 合成
  • RNA 探针标记
  • RNA 研究的 RNA 生成
  • 通过反义 RNA 进行表达控制
  • sgRNA 合成
P7460L
Poly(A) Polymerase
即将推出

催化 AMP 从 ATP 添加到 RNA 的 3’-OH,
以获得具有 poly(A) 尾部的 RNA

  • 使用 ATP 或虫草素对 RNA 进行 3' 标记
  • 对 RNA 添加 Poly(A) 尾部
  • Poly(A) 尾部增强转移到真核细胞中
    的 RNA 的翻译
 L6050L
T4 RNA Ligase 1
即将推出 单链 RNA 连接酶;也连接单链 DNA
分子
  • 单链 RNA 或 DNA 的连接
  • 单链 RNA 或 DNA 的 3'-末端标记
L6080L
T4 RNA Ligase 2
 
即将推出 连接 dsRNA 中的缺口;将 RNA 的 3’-OH 连接到
双链杂合体中的 DNA 的 5’-PO4
  • 多个寡核苷酸的模板连接
  • 含有特定位点修饰或标记的
    RNA 的合成
  • dsRNA 的缺口连接
  • 连接 DNA/RNA 双链体中 RNA 的 3’-OH 与 DNA
    的 5’-PO4

L6070L
T4 RNA Ligase 2
(Truncated) 

即将推出 催化预腺苷酸化 5’ 磷酸(DNA 或 RNA)
与 RNA 的 3’ 羟基之间的
磷酸二酯酶键形成
  • 通过连接头将预腺苷酸化 5’ DNA
    连接至 3’ 羟基 RNA
  • 小 RNA 克隆和测序

核糖核酸酶保护实验 (RPA) 是一种使用 RNase A 测定相对或绝对转录物丰度以及绘制 mRNA 末端和内含子/外显子边界的技术。

单碱基置换可以通过一种涉及对 RNA:DNA 异源双链中的单碱基错配进行 RNase A 剪切的简单酶方法进行检测和定位。

    作用 应用
19101
RNase A
   在 C 和 U 残基处降解 ssRNA 的核糖核酸内切酶*
  • 测定相对或绝对转录物丰度
  • 绘制 mRNA 末端和内含子/外显子边界 (RPA)
  • 绘制 DNA 或 RNA 中的单碱基突变
  • 去除质粒和基因组 DNA 制剂中的 RNA
  • 去除重组蛋白制剂中的 RNA
Y9220L
RNase H
即将推出 用于水解与 DNA 杂交的 RNA 的磷酸二酯键的
核糖核酸内切酶
RNase H 活性可降解 DNA:RNA 复合体的 RNA
模板,从而释放单链 cDNA 作为合成第二链
cDNA 的模板
Y9240L
RNase Inhibitor
即将推出 RNase A、B、C 的猪源性非竞争性抑制剂;
不抑制 RNase H 活性。
保护 RNA 不被降解;通常用作 RNA 酶法
操纵的预防措施
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逆转录酶是如何起作用的?
逆转录酶 (RT) 也称为 RNA 依赖性 DNA 聚合酶,是一种将单链 RNA 转录成 DNA 的 DNA 聚合酶。逆转录病毒 RT 具有三种贯序的生化活性:RNA 依赖性 DNA 聚合酶活性、核糖核酸酶 H (RNase H) 以及 DNA 依赖性 DNA 聚合酶活性。总之,这些活性使该酶能够将单链 RNA 转化为双链 cDNA。逆转录酶被 HIV 和乙型肝炎等病毒用来复制其基因组。逆转录酶也被逆转录转座子移动遗传元件用于在宿主基因组内进行增殖,以及被真核细胞用于延长其线性染色体末端的端粒。
逆转录酶在分子生物学领域有什么作用?
逆转录酶在分子生物学领域被用于通过扩增过程检测和操纵 RNA 分子。新合成的起始点是一种称为引物(与 RNA 模板结合)的短 DNA 寡核苷酸。逆转录酶聚合形成与原始 RNA 模板互补的 DNA 链,后者被称为 cDNA。然后,cDNA 可以通过 PCR、定量 PCR 或等温方法进一步扩增。
RNA 聚合酶有什么功能?

RNA 聚合酶在局部打开双链 DNA,从而使暴露出的一条核苷酸链可以用作 RNA 合成的模板;这是转录的过程。在 DNA 复制中,DNA 解旋酶将 DNA 双螺旋的两条链分开,形成一种称为复制叉的结构,以暴露出两条单链。然后,复制 DNA 聚合酶使用每条链作为模板来构建新的匹配 DNA 链。在 DNA 转录中,RNA 聚合酶的作用是解开 DNA 并合成前 mRNA。 

引发酶是一种 DNA 依赖性 RNA 聚合酶,在 DNA 复制中起着重要作用。在起始位点通过解旋酶解开亲代 DNA 链后,引发酶在每个模板链上组装短 RNA 引物,然后通过复制 DNA 聚合酶使用脱氧核苷酸进行延伸。RNA 聚合酶 II 是一种在真核生物中利用 DNA 合成 mRNA 的酶,不需要引物来启动合成。对引物的要求因病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶而异。逆转录酶需要 tRNA 引物。 

真核细胞含有三种 RNA 聚合酶,它们转录不同种类的基因。蛋白质编码基因由 RNA 聚合酶 II 转录;RNA 聚合酶 I 和 III 则负责转录核糖体 RNA (rRNA) 和转运 RNA (tRNA)。线粒体基因组的转录是由与噬菌体 T7 RNA 聚合酶有远亲关系的 RNA 聚合酶进行的

poly(A) 聚合酶有什么作用?
poly(A) 聚合酶,又称多核苷酸腺苷酰转移酶,使用单链 RNA 作为引物催化腺嘌呤残基掺入 RNA 的 3’ 末端,并有效地将 poly(A) 尾部添加到 RNA 中。poly(A) 聚合酶是一种不依赖于模板的聚合酶,属于 X 族核苷酸转移酶超家族成员,该家族成员还包括末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)。
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